Page 144 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 水 产 学 报 50 卷

用于实时荧光定量 PCR 分析。使用 Primer Premier Cycler 480 Ⅱ(Roche， 瑞 士 ) 进 行 实 时 荧 光 定 量
®
5.0 软件设计特异性引物，如表 2 所示。实时荧光 PCR 反应。实时荧光定量 PCR (SYBR Premix Ex
®
定量 PCR 反应体系 (20 μL) 由 10 μL GoTaq qPCR Taq Ⅱ，TaKaRa) 反应条件：95 ℃，5 min；95 ℃，
Master mix、0.4 μL cDNA、0.4 μL 上游引物、0.4 μL 20 s；57 ℃，25 s，40 个循环；72 ℃，25 s。以内
下游引物和 8.8 μL 无菌水组成。使用 Roche Light 参基因 (β-actin) 为对照基因，采用 2 −∆∆C t 方法分

表 2 用于实时荧光定量 PCR 分析的引物
Tab. 2 Primers used for real-time qPCR analysis from M. salmoides
基因 引物序列 产物大小/bp
genes primer sequence (5′-3′) product size
肿瘤坏死因子-α F: CTTCGTCTACAGCCAGGCATCG 161
tnf-α R: TTTGGCACACCGACCTCACC
白细胞介素-1β F: CGTGACTGACAGCAAAAAGAGG 166
il-1β R: GATGCCCAGAGCCACAGTTC
白细胞介素-8 F: CGTTGAACAGACTGGGAGAGATG 112
il-8 R: AGTGGGATGGCTTCATTATCTTGT
固醇调节元件结合蛋白1 F: AGTCTGAGCTACAGCGACAAGG 127
srebp1 R: TCATCACCAACAGGAGGTCACA
脂肪酸合成酶 F: TGTGGTGCTGAACTCTCTGG 121
fas R: CATGCCTAGTGGGGAGTTGT
乙酰辅酶A羧化酶 F: GTATCTCTACCTCACGCCTCAG 170
acc R: CTCCAGCAATCATTCCAGACC
甘油二酯酰基转移酶1 F: AGACTGGTGGAACTCTGAGAC 171
dgat1 R: ACTAGGTACTCGTGGAAGAAGG
激素敏感性脂肪酶 F: GAAGATCATATCCAGCGGCATC 157
hsl R: TCCATAGGCATTGAGGCACTT
过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1 F: CAGTTCTGTTCGTCACCAGTC 173
acox1 R: CGTTGATGTCTCCGCTGATG
肉毒碱棕榈酰基转移酶1 F: GATGTTTTATGACGGGCGG 156
cpt1 R: TAGGTTTCACGAGCATTGGC
过氧化物酶体增殖物受体α F: CCACCGCAATGGTCGATATG 144
pparα R: TGCTGTTGATGGACTGGGAAA
B细胞淋巴瘤因子-2相关X蛋白 F: GCTTGTCACCACAGCCATTG 134
bax R: TACAGCAGACCAGCACAAGG
B细胞淋巴瘤因子-2 F: CCAACGTCATGGTTGTCATGG 70
bcl-2 R: GTGGAGCCAACCAGGAATCT
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 F: GCTTCATTCGTCTGTGTTC 98
caspase3 R: CGAAAAAGTGATGTGAGGTA
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9 F: CTGGAATGCCTTCAGGAGACGGG 125
caspase9 R: GGGAGGGGCAAGACAACAGGGTG
β-肌动蛋白 F: CTCTGCATACATGCCTACAC 117
β-actin R: GTAGAGTTTCTCCCCATCAGG

析目的基因的相对表达量。 将 1×上样缓冲液 (含 SYB Green) 与 PCR 产物等体

1.8 肠道菌群分析 积混合，2% 琼脂糖凝胶电泳。选取主波段亮度
在 400~450 bp 的样本进一步实验。随后，混合
采用 CTAB/SDS 法提取样本总基因组 DNA。
PCR 产物使用 Gene JET 凝胶提取试剂盒 (赛默飞，
用 1% 琼脂糖凝胶测定 DNA 浓度和纯度，用无菌
美 国 ) 进 行 纯 化 。 使 用 Illumina 的 NEB Next ®
水稀释 DNA 至 1 ng/μL。采用 515 条 F-907R 引物
扩增样本的 V4~V5 区。采用条形码特异性引物扩 Ultra™ DNA 文库准备试剂盒 (NEB，美国) 生成
增 16 S rRNA 基因。所有 PCR 反应均采用 15 µL 测序文库，并添加索引代码。使用 Qubit@ 2.0 荧
®
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix 进行。PCR 光仪 (赛默飞，美国) 和 Agilent Bioanalyzer 2100
扩增步骤：98 ℃ 初始变性 1 min，98 ℃ 变性 10 s， 系统进行文库质量评估。在 Illumina MiSeq 平台
50 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 60 s，72 ℃ 延伸 5 min。 上对文库进行测序，获得 250 bp/300 bp 的成对端

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