Page 45 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 严孟芝，等：大口黑鲈 IL-12 表达分析及异构体组成形式鉴定 50 卷

基因在整个感染期间的头肾和脾脏中表达量均低 分别与 p40a/b/c 组合的二聚体蛋白序列和小鼠 IL-
于健康对照组水平。而 p35a、p40a 和 p40b 在头 12 模板 (PDB：8cr6.1) 序列相似度最佳，相似度
肾和脾脏中表达模式不同。 分别为 34%、34% 和 33%。基于小鼠 IL-12 晶体
结构 (PDB：8cr6.1) 进行同源建模，构建 3 个复合
2.4 大口黑鲈 IL-12 蛋白真核表达
物 的 三 维 结 构 (图 6)。 全 局 模 型 评 估 值 (QME-
Western blot 结果显示，大口黑鲈 IL-12 亚基 ANDisCo Global) 均大于 0.5，说明模型均具有参
基因 p35a、p40a、p40b 和 p40c 在 HEK293T 细胞 考意义。PyMOL 软件分析 p35 和 p40 亚基之间相
中均成功表达并被翻译成相应的蛋白质 (图 5)。4 互作用力、结合位点以及结合面静电势分布，结
个蛋白的实际分子质量均高于预测值 (p35a-Flag、 果显示，p35a 与 p40a/p40b/p40c 的 3Å结合口袋内
p40a-3×Flag、 p40b-3×Flag 和 p40c-3×Flag 融 合 蛋 均能形成多个氢键 (图 6-b，f~g)。此外，p35a 中
白 的 理 论 分 子 质 量 分 别 为 23.4、 39.7、 44.4 和 C 分别与 p40a 中 C 、p40b 中 C 207 处于同一对接
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42.9 ku)，推测是由于真核表达系统中发生糖基化 面且间距 2.0Å，可能形成链间二硫键。而 p35a
修饰作用使重组蛋白实际分子质量大于理论值。 与 p40c 链间未观察到可能形成二硫键的位点。静
经糖基化位点预测分析表明，在 p35a 中含有 3 个 电势分析表明，p35a 结合面富集正电残基 (如 Arg、
O-糖基化位点 T79、S154、S163 和 1 个 N-糖基化 Lys)， p40a/p40b/p40c 的 结 合 富 集 负 电 残 基 (如
位点 N50；p40b 蛋白中存在 3 个 O-糖基化位点 Asp、Glu) (图 6-c~e，h~j)，提示 p35a 与 3 个p40
T180、 S182、 S183 和 5 个 N-糖 基 化 位 点 N19、 通过表面形成稳定的静电相互作用，从而稳定二
N91、N103、N231、N253；在 p40c 蛋白中，存 聚体结构。综上推测大口黑鲈可能形成 p35a+
在 2 个 O-糖基化位点 T300、S311 和 4 个 N-糖基 p40a、p35a+p40b 和 p35a+p40c 三种 IL-12 异构体。
化位点位 N38、N73、N226、N340。p40a 蛋白仅
2.6 大口黑鲈 IL-12 亚基蛋白-蛋白互作验证
预测到 N-糖基化位点 N88、N101、N113、N277。
为了进一步验证 p35 与 p40 之间是否在同一
以上这些预测的位点均有可能发生糖基化修饰，
细胞内形成相应异构体并且发生蛋白-蛋白相互作
使 IL-12 形成具有生物活性的蛋白。
用，通过 p35a-Flag、p40b-Myc 和 p40c-Myc 真核
2.5 大口黑鲈 IL-12 异构体互作形式预测 表达质粒按 p35a+p40b(质量比 1∶1) 和 p35a+p40c
通过 SWISS-MODEL 筛选发现大口黑鲈 p35a (质量比 1∶1) 的比例共转至 HEK293T 细胞，进行

Co-IP 实验验证。结果显示，p35a-Flag 作为诱饵
ku M 1 2
70 蛋白进行的 IP 实验能够检测到 p40b-Myc 和 p40c-
55
40 Myc(图 7-a)。反之，使用 p40b-Myc 与 p40c-Myc
ku M 1 2 3 4 5
35 70 作为诱饵蛋白，Western blot 结果中依旧能检测到
25 55 p35-Flag(图 7-b)。分别使用单标签 和 Myc 进
40 Flag
15 行 IP 实 验 时 ， Western blot 均 未 检 测 到 对 应 的
(a) (b) p40b-Myc/p40c-Myc 或 p35a-Flag， 证 明 p35a 与
图 5 大口黑鲈 IL-12p35 和 IL-12p40 蛋白在 p40b、p40c 的互作具有特异性 (图 7-c~d)。上述结
HEK293T 细胞中表达的免疫印迹 果表明，p35a 与 p40b、p35a 与 p40c 能够在同一
使用兔抗 Flag 单克隆抗体和偶联 HRP 的山羊抗兔 IgG(H+L) 进行
细胞中发生相互作用，大口黑鲈 IL-12 能形成
杂交。(a) M.蛋白 Marker，1.大口黑鲈 IL-12p35a 蛋白，2. Flag 阳
p35a+p40b 和 p35a+p40c 异构体形式。
性 对 照 ； (b) M. 蛋 白 Marker， 1.p3×Flag-CMV 空 载 ， 2. p40a-
3×Flag 蛋白，3. p40b-3×Flag 蛋白，4. p40c-3×Flag 蛋白，5. Flag 阳
2.7 大口黑鲈 IL-12 功能验证
性对照。
Fig. 5 Western blot of M. salmoides IL-12p35 and 在哺乳动物中，IL-12 能够通过多种不同机
IL-12p40 proteins expressed in HEK293T cells 制上调 IFN-γ 基因表达水平。本研究在大口黑鲈
Hybridization was performed using rabbit anti-Flag monoclonal anti- 体内过表达两种融合蛋白 p40b-p35a 和 p40c-p35a，
body and HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG(H+L). (a) M. protein
并设置空载对照，采用荧光定量 PCR 检测了两种
marker, 1. IL-12p35a protein, 2. Flag positive control. (b) M. protein
融合蛋白对大口黑鲈脾脏中 IFN-γ 基因表达的影
marker, 1. p3×Flag-CMV empty vector, 2. p40a-3×Flag protein, 3. p40b-
3×Flag protein, 4. p40c-3×Flag protein, 5. Flag positive control. 响。结果表明，两种 IL-12 质粒在大口黑鲈体内
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