Page 40 - 《水产学报》2026年第01期
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1 期                                     水    产    学    报                                 50 卷

              而 获 得 高 质 量 数 据    (clean reads)。 通 过  HISAT2    p40a-Myc、p35a-Flag+p40b-Myc、p35a-Flag+p40c-
              (v2.0.5) 将  clean reads 比对至大口黑鲈参考基因组             Myc 以质量比    1∶1  的比例共转染       HEK293T  细胞。
              (NCBI： ASM1485139v1)。 采 用        featureCounts   按“细胞培养和转染”所述的方法培养细胞和收集
              (v1.6.3) 对外显子区匹配       reads 进行统计，生成原            细胞裂解液样品用于          IP  实验。具体操作：将细胞
              始  read count 矩阵，并通过基因长度标准化后计                    裂解液样品与耦联小鼠抗            Flag  抗体  (MedChemEx-
              算  TPM  值  (Transcripts Per Million)，将  TPM  值作  press：HY-K0207) 或  Myc 抗体  (MedChemExpress：
              为基因表达水平评价指标。为了可视化基因表达                            HY-K0206-1) 的磁珠混合孵育。孵育前使用洗涤
              模式及表达变化，TPM           值进行    Z-Score 标准化处        缓冲液    (PBST：PBS+0.05% Tween-20) 平衡磁珠，
                             [32]
              理后绘制成热图  。                                       在 室 温 下 连 续 旋 转 孵 育 90  min。 用 裂 解 液
                                                               (P0013J) 洗涤磁珠   4~5  次，用以去除未结合的蛋
               1.5    大口黑鲈  IL-12  真核表达质粒的构建
                                                               白 或 非 特 异 性 结 合 的 蛋 白 。 最 后 加 入        50  μL
                   使用酶切和       T4  连接的方法，将目的片段
                                                               2×SDS-PAGE  蛋白上样缓冲液，100 ℃          下金属浴
              连 接 到   pcDNA3.1+和  p3×Flag-CMV  过 表 达 载 体       10 min。在磁力架上去除磁珠。使用兔抗                   Myc
              上，构建    pcDNA3.1-p35-Flag、pCMV-3×Flag-p40a、      (16286-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司) 和兔
              pCMV-3×Flag-p40b 和  pCMV-3×Flag-p40c 真 核 表       抗  Flag (20543-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公
              达质粒，并在       HEK293T  细胞   (人胚胎肾细胞      293，     司) 抗体进行     Western blot 检测，确定     p35  和  p40
              HEK293T) 中进行表达测试。此外，还构建               pcDNA
                                                               的沉淀情况。IP       实验前，预留       40 μL  的细胞裂解
              3.1-p40a-Myc、 pcDNA3.1-p40b-Myc 和  pcDNA3.1-     液用作   Input 对照样品    (未经磁珠富集)，用于检测
              p40c-Myc 用 于 后 续 的 免 疫 共 沉 淀      (co-immuno-    目标蛋白在原始裂解液中的表达水平，以验证后
              precipitation，Co-IP) 实验。                         续实验结果的可靠性。

               1.6    细胞培养和转染                                   1.8    大口黑鲈  IL-12  功能验证
                   为了检测     p35  和  p40  蛋白表达，将   HEK293T          为验证    IL-12  在大口黑鲈体内是否具有诱导
              细胞在含     10%  胎牛血清    (翌圣生物科技上海股份                IFN-γ 的能力，通过柔性连接肽           (GS linker) 将大口
              有限公司) 和     1%  青霉素/链霉素      (北京索莱宝科技            黑鲈  p40b  亚基和   p40c 分别与   p35a 进行融合，构
              有限公司) 的      DMEM  培养基    (赛默飞世尔科技有              建  pcDNA3.1-p40b-p35a 和  pcDNA3.1-p40c-p35a 融
              限公司) 中于     37 ℃、5% CO 培养，并每日传代。                 合表达质粒。以       pcDNA3.1  空载作为对照组，两种
                                       2
              使用   BeyoPEI™转染试剂      (上海碧云天生物技术股               融合表达质粒       pcDNA3.1-p40b-p35a 和  pcDNA3.1-
              份有限公司：C0541) 进行          HEK293T  细胞转染。          p40c-p35a 为实验组，向每尾鱼注射          25 μg/尾质粒。
              转染时将细胞在         Opti-MEM(赛默飞世尔科技有限               统一选择背鳍支鳍骨左侧基部的肌肉作为注射部
              公司) 培养基中培养         6 h，随后更换为含       10%  胎牛      位  (肌内注射)，注射       4  天后，提取大口黑鲈注射
              血清和    1%  青霉素/链霉素的      DMEM   培养。24 h  后，      部位肌肉和脾脏         RNA  并反转录成      cDNA，通过
              收集细胞样本，用磷酸盐缓冲液                   (PBS，pH  为      qPCR  检测融合表达质粒的过表达效率和                IFN-γ 基
              7.2~7.4) 洗涤  2~3  次去除未结合的转染试剂，保留                 因表达水平。注射所使用的质粒遵循                 Magen  质粒
              细胞沉淀。置于细胞裂解缓冲液                (P0013J，上海碧        大提试剂盒     (p1156-03，广州美基生物科技有限公
              云天生物技术股份有限公司) 中，冰上裂解                  30 min。    司) 的操作说明进行提取，质粒               DNA  浓度采用
              通过   4℃，13 000×g   离心  10 min  去除沉淀。收集           Nanodrop-8000  分光光度计测量，随后以双蒸水稀
              上清液，加入       5×SDS  蛋白上样缓冲液，100 ℃         金      释质粒样品，以确保其浓度统一为                (250±5) ng/µL。
              属浴   10 min，Western blot 检测各蛋白表达，并设
                                                                1.9    数据分析
              置阳性对照。
                                                                   对实验数据进行统计分析，所有数据结果均
               1.7    免疫共沉淀   (Co-IP)
                                                               用平均值±标准误        (mean±SE) 表示。使用单因素方
                   为了探究不同组合          IL-12  亚基  p35  和  p40  在  差分析   (One-Way ANOVA) 进行不同组间基因表
              细胞内的相互作用，不同组合质粒                    p35a-Flag+    达差异性统计检验，若基因在不同组织间的差异

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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