Page 39 - 《水产学报》2026年第01期
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1 期                   严孟芝，等：大口黑鲈         IL-12  表达分析及异构体组成形式鉴定                           50 卷

              使用   PyMOL  软件对    3D  模型进行可视化及深入分               p35  亚基和  p40  亚基基因序列。随后从           3  尾健康
              析  ，重点关注        IL-12  复合体亚基的结合位点氨               大口黑鲈的不同组织采集样本，使用                  Trizol 试剂
                 [28]
              基酸、相互作用力以及复合体表面静电势的分布。                           (TaKaRa，日本) 抽提总       RNA，使用反转录试剂
              此外，利用      NetOGlyc-4.0 (https://services.healthtech.  盒  (南 京 诺 唯 赞 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 ) 合 成
              dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/)   [29]  和  NetNGlyc1.0  cDNA。利用  SnapGene 软件设计带有酶切位点和
              (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-  蛋白标签的引物  (表  1)，通过  RT-PCR  扩增大口黑
              1.0/) 程序分别预测大口黑鲈          IL-12  不同亚基中潜          鲈  IL-12  的开放阅读框。使用       Trizol 试剂  (TaKaRa
              在的   O-糖基化位点和       N-糖基化位点  。                   宝日医生物技术有限公司) 从健康大口黑鲈头肾、
                                              [30]
                                                               肝脏、脾脏、体肾、肌肉、后肠组织中提取                   RNA，
               1.3    大口黑鲈  IL-12  基因克隆与组织表达检测
                                                               并使用反转录试剂盒         (南京诺唯赞生物科技股份有
                   通过本地     Blast 分析，在大口黑鲈全基因组                 限公司) 反转录为       cDNA。以   β-actin  作为内参，通
              (NCBI：ASM1485139v1)   [31]  中比对到大口黑鲈      IL-    过实时荧光定量        PCR (qPCR) 检测  IL-12  亚基在不
              12  亚基基因，经筛选并去除重复，获得大口黑鲈                         同组织中的相对表达量。


                                                  表 1    本研究中所用的引|物
                                               Tab. 1    Primers used in this study
                  引物名称                                    引物序列(5'-3')                                用途
                 primer name                            primer sequence (5'-3')                      usage
                KpnI-p35a-F  GAGACCCAAGCTTGGTACCATGCCCTTCATCAAGCTCTACTTCAC                          RT-PCR
                p35a-Flag-XhoI-R  CCGCTCGAGTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCTTTAGTGTGTTCTCCAGAGTTC        RT-PCR
                EcoRI-p40a-F  GCCAGTGTGCTGGAATTCATGCATGCATTGTTCCTTATG                               RT-PCR
                p40a-Myc-XhoI-R  CATGCTCGAGCTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGCAGGTCACAACATCTTTATTC  RT-PCR
                KpnI-p40b-F  GAGACCCAAGCTTGGTACCATGAAGTTATTTGTTTTCGGCATTG                           RT-PCR
                p40b-Myc-XhoI-R  CATGCTCGAGTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTTGTTTGTTTTTACGATGTCTGTTG  RT-PCR
                KpnI-p40c-F  GAGACCCAAGCTTGGTACCATGAAGCCTGTGTCACTG                                  RT-PCR
                p40c-Myc-XhoI-R  CATGCTCGAGTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCAGATGTCTGGCTCCTGTTAGG   RT-PCR
                p35a-F       TGTGTGTGCACCAAAGGAGT                                                  RT-qPCR
                p35a-R       TTGGACGGTCTACAGCAACC                                                  RT-qPCR
                p40a-F       CAGTGATGGGACGGTGTTCA                                                  RT-qPCR
                p40a-R       ACTGGTGTGCTTGTCCTGAG                                                  RT-qPCR
                p40b-F       GGCATTGTGTGTGCGTTTCT                                                  RT-qPCR
                p40b-R       GTTTCCTCTCTGCGCTTCCT                                                  RT-qPCR
                p40c-F       TCTCACCCTACGCTGAGGAA                                                  RT-qPCR
                p40c-R       AGCTGGACGGTGGATCAATG                                                  RT-qPCR
                MS-β-actin-F  CCACCACAGCCGAGAGGGAA                                                 RT-qPCR
                MS-β-actin-R  TCATGGTGGATGGGGCCAGG                                                 RT-qPCR

               1.4    大口黑鲈  IL-12  时间序列转录组测序                   RNA  酶琼脂糖凝胶电泳检测           RNA  的质量，针对
                                                                                                    TM
                   向 规 格 为   (40±5)  g  的 大 口 黑 鲈 注 射  1×10 3  质量合格的      RNA  样品按照    Illumina Truseq  RNA
              CFU/尾的鰤鱼诺卡氏菌           NSFS01，分别在注射后             sample prep Kit 方法构建文库，之后送至上海凌恩
              第  1、2、4、8、16     天取头肾和脾脏组织样品，                   生物科技有限公司         Illumina HiSeq 2500  平台进行
              使用   Trizol 试剂从脾脏及头肾中提取总            RNA。确        二代测序     (双端  100 bp)。获得的原始测序数据经
              保每条鱼的总        RNA  样品独立，并设置每组样品                  Trimmomatic (v0.36) 过滤  reads 中的接头序列、低
              3  个 重 复 。 通 过   Nanodrop  检 测 样 品  RNA  纯 度     质量碱基     (Phred  值<20)、含  N  比率超过     10%  的
              (OD 260/280 =1.8~2.2， OD 260/230 ≥2.0)， 并 且 使 用 无  reads 以及质量修剪后长度小于         75 bp  的序列，从

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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