Page 49 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 严孟芝，等：大口黑鲈 IL-12 表达分析及异构体组成形式鉴定 50 卷

出负电性。这与上述描述的异源二聚体结合面静 的挑战。通过原核纯化能够产生具有生物活性的
电分布特点是一致的。在智人 IL-12 晶体研究中， IL-12 [54-55] ，但因原核表达的蛋白缺少相应的翻译
p35 和 p40 之间的静电相互作用是主导二聚体形 后修饰，其生物学功能的发挥受到限制。通过调
成的关键因素。p35 结合面带正电的精氨酸 (Arg) 整质粒比例并共转 p35 和 p40 或通过两个不同启
R 189 与 p40 结 合 面 带 负 电 的 天 冬 氨 酸 (Asp， D) 动子在同一个质粒中等比例表达 p35 和 p40，能
D 290 形成强有力的电荷互补，p35 的 R 189 插入 p40 够获得少量但纯度不高的 p70。在鱼类 IL-12p35
亚基中由酪氨酸 (Tyr，Y) Y 、Y 、Y 、Y 293 与 p40 之间通过 GS linker 连接可以获得完整的
292
246
114
形成的疏水口袋中，与口袋内部 D 290 形成强烈的 p35 和 p40 融合的重组蛋白质 [18, 56] ，并发挥 IL-12
静电相互作用。当分别突变 R 189 和 D 290 后，两亚 的生物活性，但 GS linker 的加入可能增加了新的
基均无法形成二聚体 p70，而突变疏水口袋中的 抗原表位。肝素亲和纯化能够捕获完整的 IL-12，
酪氨酸 Y 114 则对二聚体的形成无影响 [45,50] 。在本 虽在一定程度上降低了 IL-12 纯化成本，并且能
研究中，大口黑鲈 p35a 亚基上的精氨酸 R 187 与 够排除蛋白质标签 (如 6×His、3×Flag) 等干扰 [57] ，
p40a 的 D 、p40b 的 D 326 以及 p40c 的 D 282 均处在 但在实际生产过程中仍不算是一种廉价的亲和材
300
同一结合面且存在静电相互作用 (图 6-b，f~g)， 料。尽管纯化方法困难，IL-12 因其显著的免疫增
强特性，仍然以多种形式用于免疫佐剂的开发中。
推测大口黑鲈 p35a 亚基中 R 187 分别与 p40a/b/c 亚
326
300
基中 D /D /D 282 产生静电相互作用，以维持二聚 IL-12 重组蛋白作为疫苗佐剂在使鱼类抵抗鰤鱼诺
卡氏菌入侵中提供了良好的免疫保护效果 [56] 。IL-
体的稳定。此外，在智人 IL-12p40 中的谷氨酸
183
(Glu，E) E 181 能同时与 p35 亚基的 R 、苏氨酸 12 以 DNA 形式作为疫苗佐剂，也在肿瘤治疗 [58] 、
抵抗胞内寄生菌感染 [59] 、病毒感染 [10] 以及寄生虫
186
(Thr，T) T 形成氢键网络，进一步稳定 IL-12 二
入侵 [60-62] 等领域有着广泛的研究。
聚 体 结 构 。 本 研 究 中 大 口 黑 鲈 p40a/b/c 中 的
211
181
181
E /E /E 188 均能同时与 p35a 中的 R 、T 184 形成 （作者声明本文无利益冲突）
类似的氢键网络 (图 6-b，f~g)。在进化的过程中，
同种蛋的结构及功能在不同物种中呈现出保守性， 参考文献 (References)：
并且在整体表面电荷高度保守 ，当蛋白质某个 [ 1 ] Kobayashi M, Fitz L, Ryan M, et al. Identification and purifica-
[51]
结构域或位点产生静电突变后，极有可能无法与 tion of natural killer cell stimulatory factor (NKSF), a cytokine
相应的蛋白发生互作 。从进化的角度，本研究 with multiple biologic effects on human lymphocytes[J]. The
[52]
对比了智人、小鼠、大口黑鲈 p40 亚基结合面的 Journal of Experimental Medicine, 1989, 170(3): 827-845.
静电势分布，发现大口黑鲈 p40 亚基与智人和小 [ 2 ] D’Andrea A, Rengaraju M, Valiante N M, et al. Production of
鼠 p40 亚基结合面的电势分布呈现高度的相似性， natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peri-
推断在进化的过程中，大口黑鲈 IL-12 保留了结 pheral blood mononuclear cells[J]. The Journal of Experi-
合面带特定电荷的氨基酸，在 p35a 与 p40a/b/c 亚 mental Medicine, 1992, 176(5): 1387-1398.
基中，带有特定电荷且与二聚体形成的必要氨基 [ 3 ] Macatonia S E, Hosken N A, Litton M, et al. Dendritic cells
酸位点保守，使各个亚基结合面的电性保守，从 produce IL-12 and direct the development of Th1 cells from
+
naive CD4 T cells[J]. The Journal of Immunology, 1995,
而维持完整复合体的正确折叠、组装。
154(10): 5071-5079.
IL-12 自从被发现以来，有关其功能已经被
[ 4 ] Manetti R, Parronchi P, Giudizi M G, et al. Natural killer cell
研究了三十余年，IL-12 蛋白的纯化是研究其结构
stimulatory factor (interleukin 12 [IL-12]) induces T helper type
和功能的基础。早期研究从 192 L 人 B 淋巴母细
1 (Th1)-specific immune responses and inhibits the develop-
胞样细胞系 RPMI8866 的培养基中纯化 IL-12，然
ment of IL-4-producing Th cells[J]. The Journal of Experi-
[1]
而产量仅为 18 μg 。由于完整的 IL-12 是由不同
mental Medicine, 1993, 177(4): 1199-1204.
基因编码的不同亚基 p35 和 p40 组成，p40 亚基易 [ 5 ] Magram J, Connaughton S E, Warrier R R, et al. IL-12-defi-
分泌到胞外，而 p35 大多停留在细胞内质网中， cient mice are defective in IFNγ production and type 1 cytokine
p35 的分泌需要 p40 的诱导 [43, 53] ，这一特点导致纯 responses[J]. Immunity, 1996, 4(5): 471-481.
化出完整的具有生物活性的 IL-12p70 面临着巨大 [ 6 ] Trinchieri G. Interleukin-12: a proinflammatory cytokine with

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