Page 219 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 李中林，等：基于胶体金免疫层析技术快速检测鱼糜中的卵白蛋白 50 卷

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80 ku 处的条带为 OVA 的二聚体 。加入还原剂 M 1 2 3 4 5 6
后的 OVA 分子质量在 45 ku 处呈单一蛋白条带， ku
180
这与报道的还原条件下 OVA 理论分子质量一致 。 100
[9]
70
为进一步验证该蛋白条带是否为目的蛋白 55
40
OVA，将还原条件下的 OVA 蛋白条带切胶回收
35
后进行质谱鉴定分析。质谱鉴定共扫描得到了 25
195 个肽段，含 385 个氨基酸残基。图 1-c 是该蛋
白条带的其中一个二级质谱图，与鸡 (Gallus gal- 15
lus) OVA 氨基酸序列比对覆盖率为 99%，证明本
研究纯化得到了高纯度鸡 OVA。 10
(a)
2.2 抗 OVA 多克隆抗体的特异性分析
M 1 2 3 4 5 6
以高度纯化的鸡 OVA 免疫小鼠，通过 Pro- ku
tein G 亲和层析柱纯化小鼠血清，得到抗 OVA 多 100
70
克隆抗体 IgG。用 Western blot 分析抗体的特异性。 55
40
图 2-a 为还原条件下鸡蛋清全蛋白，咸鸭蛋清全 35
蛋白，鲢、草鱼、蓝圆鲹和凡纳滨对虾 (Litopen- 25
aeus vannamei) 的肌肉全蛋白 SDS-PAGE。图 2-b
为 Western blot 结果，制备的抗 OVA 多克隆抗体 15
对鸡、鸭蛋清中的 OVA 均有特异性反应，与蛋清
10
中的其他蛋白及 3 种鱼肉肌肉蛋白和凡纳滨对虾
肌肉蛋白不产生免疫交叉反应。鉴于鸡 OVA 和 (b)

[25]
鸭 OVA 的蛋白同源性高达 81% ，所制备的抗 图 2 抗 OVA 多克隆抗体的特异性分析
OVA 多克隆抗体对鸡 OVA 和鸭 OVA 均有特异性 (a) SDS-PAGE；(b) Western blot。M.标准蛋白，1.鸡蛋清，2.咸鸭
反应且亲和力较好，可用于后续实验。 蛋清，3.鲢，4.草鱼，5. 蓝圆鲹，6. 凡纳滨对虾。
Fig. 2 Specificity analysis of anti-OVA
2.3 胶体金溶液的制备
polyclonal antibody
采用传统的柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶 (a) SDS-PAGE; (b) Western blot. M. molecular weight marker; 1. hen
液，通过紫外可见光光谱和目测观察对其进行表 egg white, 2. salted duck egg white, 3. H. molitrix, 4. C. idella, 5. C.
征，图 3-a 是通过紫外可见光扫描光谱表征其粒 crysos, 6. L. vannamei.
[27]
3
径，500~550 nm 为其特征峰，最大吸收波长在 0.2 mol/L K CO 来 定 义 pH 。 如 图 4-a 所 示 ，
2
527 nm，对应的最大吸光值为 3.49，峰形较窄、 1 mL 胶 体 金 -抗 体 耦 合 物 溶 液 的 OD 52 0 值 随 着
3
波形光滑。目测观察结果如图 3-b 所示。胶体金 0.2 mol/L K CO 的增加不断增大。当 0.2 mol/L
2
3
溶液清澈透亮，呈酒红色，无悬浮物和沉淀，判 K CO 添加量为 10 µL 时，OD 52 0 达到最大值，此
2
断胶体金溶液质量良好。 后变化幅度不大。表明在 1 mL 胶体金溶液中加
入 10 µL 的 0.2 mol/L K CO ，金颗粒与抗体蛋白
2.4 金标抗体最佳 pH 值和最佳抗体蛋白用量 2 3
吸附效果最好，此时的溶液达到标记抗体的最适
的确定
pH， 故 而 选 择 1 mL 胶 体 金 溶 液 中 0.2 mol/L
胶体金溶液颗粒易受 pH 值、盐离子、温度 K CO 的最适添加量为 10 µL。如图 4-b 所示，随
3
2
等因素的影响。因此，金标抗体在制备过程中应 着抗体添加量的增加，胶体金-抗体耦合物 OD 520
保持整体稳定，使胶体金与抗体之间较好地进行 值逐渐增大，当每毫升胶体金溶液中抗体浓度为
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耦联，提高耦联成功率，减少“死金”现象发生 。 0.075 mg/mL 时，OD 52 0 为最大值，之后随着抗体
在金标抗体制备过程中，主要考虑胶体金溶 添加量继续增大，OD 52 0 的值未出现显著升高，
液的 pH 以及抗体蛋白的最佳添加量。由于胶体 表明体系达到稳定状态。此时即为胶体金溶液中
金溶液易损坏 pH 计探头，采用不同添加量的 鼠抗鸡蛋 OVA 多克隆抗体的最适浓度。

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