Page 217 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 李中林，等：基于胶体金免疫层析技术快速检测鱼糜中的卵白蛋白 50 卷

限公司)；DHP-9402 电热恒温培养箱 (上海一恒科 Tris-HCl， pH 8.0) 室 温 封 闭 1 h， 用 TBST 洗 膜
学仪器有限公司)；PT-2500 组织捣碎机 (瑞士 Kin- 3 次，每次 5 min。将鼠抗鸡 OVA 多克隆抗体与
ematica 公司)；E07419 胶体金试纸分析仪 (厦门波 TBST 按 1∶10 000 (体积比) 稀释后室温孵育 NC
生生物技术有限公司)；Avanti JA-25 高速冷冻离 膜 1 h，TBST 洗膜 5 次，每次 5 min；再以 HRP
心机 (美国 Beckman 公司)。 标记的羊抗鼠 IgG 与 TBST 按 1∶20 000 (体积比)

1.3 实验方法 稀释后室温孵育 1 h，TBST 洗膜 5 次，每次 5 min。
加入 ECL 显色液至 NC 膜，室温避光孵育 3 min，
OVA 的纯化 蛋清前处理参考 Geng 等 [21]
在荧光化学发光成像系统上记录结果。
的方法并加以修改。将 30 mL 鸡蛋清用 3 倍体积的
OVA-CGIA-Strip 的制备及性能测定 胶
50 mmol/L NaCl 溶液稀释，4 ℃ 下搅动 2 h，用
[23]
体金溶液采用柠檬酸还原法制备 ，具体操作：取
6 mol/L HCl 调节 pH 至 5.0，4 ℃ 静置 0.5 h 后于
100 mL 配制好的 0.01% 氯金酸溶液搅动加热至沸
4 ℃、12 000×g 离心 25 min，取上清液。边搅动
腾，吸取 1 mL 1% 柠檬酸三钠溶液快速加入，持
上清液边加入聚乙二醇 8000 至饱和度达到 9%(质 续沸腾 10 min 后，停止加热并冷却至室温。通过
量体积比)，静置 0.5 h 后，4 ℃、12 000×g 离心 目测得到胶体金的外观特征，同时以紫外-可见分
20 min，取上清液。再边搅动边加入聚乙二醇 光光度计分析在 400~700 nm 处的吸光度，根据最
8000 至饱和度达到 15%(质量体积比)，静置 0.5 h 大吸收峰位置判断胶体金颗粒粒径及均一性，并
后，4 ℃、12 000×g 离心 20 min，取上清液，用 以此验证胶体金是否合成。
缓冲液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5) 充分透析。 金标抗体的制备 取 1 mL 胶体金溶液，
将已透析的样品上样于用缓冲液 (20 mmol/L 采用氯化钠破坏法确定最佳 pH 和最适抗体添加
Tris-HCl，pH 7.5) 预平衡的 DEAE-Sepharose 离子 量。将标记完成的金标抗体溶液采用两步法离心，
交换层析柱 (2.5 cm×20 cm)，用缓冲液流洗掉未结 所得的沉淀混合均匀后复溶，加入 500 µL 重悬工
合蛋白，用含有 0~0.2 mol/L NaCl 的缓冲液进行 作液 Base E (2×)，加水补足至 1 mL，均匀平铺在
线性洗脱，收集第 3 个洗脱峰即为纯化的目的蛋 空白玻璃纤维上，冷冻真空干燥 2 h 后取出密封
白 OVA。 即为金标垫。
SDS-PAGE 参考 Jiang 等 [22] 的方法，采 将 NC 膜平滑地贴在 PVC 底板中间位置上，
用 SDS-PAGE 对分离蛋白进行分析检测，将样品 用划膜仪划线。根据标尺位置分别将浓度为 0.8
与上样缓冲液以 1∶3(体积比) 混合后，振荡混匀， mg/mL 的抗原 OVA 和浓度为 1 mg/mL 的羊抗鼠
95℃ 加热 10 min。采用丙烯酰胺质量分数为 12% IgG 划至 NC 膜上的 T 线和 C 线处，37 ℃ 干燥至
分离胶和 5% 浓缩胶。电泳结束后，经考马斯亮 少 4 h，取出密封干燥备用。免疫层析条件主要优
蓝 R-250 显色、脱色后进行凝胶成像分析。 化检测线 T 和质控线 C 的最佳工作质量浓度以及
质谱鉴定 将纯化的 OVA 进行 SDS-PAGE 最适 NC 膜。按顺序将金标垫、样品垫和吸水纸
后，染色、脱色后切胶回收目的蛋白条带，委托 贴在底板上，用切条机切割成宽 3.5 mm 试纸条，
深圳维纳菲生物技术有限公司进行肽质量指纹图 密封保存备用。
谱鉴定分析。 OVA-CGIA-Strip 灵敏度测试 对试纸条
抗鸡 OVA 多克隆抗体的制备 取 100 µL 进行灵敏度试验，配制终浓度为 0、0.01、0.10、
纯化的鸡 OVA(2 mg/mL) 与等体积的弗氏完全佐 1.00、10.00、20.00、40.00、100.00 µg/mL 的 OVA
剂，充分乳化后，进行皮下多点注射 ICR 小鼠，每隔 标准工作液，用 OVA-CGIA-Strip 检测，各取 50 µL
2 周以相同剂量的抗原加强免疫。免疫 4 次后， 不同浓度的工作液滴加到样品垫上，反应 5 min
采血，静置待血清析出后，3 000×g 离心 10 min， 后观察显色结果。结果判定方法：阴性，T、C 线均
将血清用 Protein G 亲和层析柱纯化。抗体制备在 显色；阳性，C 线显色，T 线不显色；无效，T 线、
厦门大学医学院完成。 C 线均不显色。依靠胶体金试纸分析仪读取 T 线
Western blot 通过半干转膜方式将蛋白从 数值，以 T 线条带的光吸收值为纵坐标，各 OVA
聚丙烯酰胺凝胶转移到 NC 膜上，用含 5% 脱脂奶 浓度的对数值为横坐标，每个浓度样本平行测得
的 TBST 缓 冲 液 (含 0.5% 吐 温 -20 的 20 mmol/L 3 次，利用 Origin 2021 软件拟合线性标准曲线。

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