Page 211 - 《水产学报》2025年第11期

葛辉，等 水产学报, 2025, 49(11): 119417

NC 1 2 3 4 5 6 7
T
C

NC 1 2 3 4 5 6 7
(a) 图 3 试纸检测的特异性分析
15 T. 检测线，C. 对照线。下同。
Fig. 3 Specificity analysis of test strip detection
*
相对荧光强度 relative fluorescence 10 2.4 灵敏度分析 RPA-CRISPR/Cas12a 荧光检测
T. test line, C. control. The same below.

本实验使用
5
RPA-CRISPR/Cas12a 试纸检测
种技术手段，
和
2
分别对一系列浓度梯度 (10 、10 、10 、10 、
5
4
3
6
0
NC 1 2 3 4 5 6 7 10 、10、1 和 0 CFU/mL) 的沙氏弧菌样本进行
2
不同处理组
different treatment groups 系统性评估。基于 RPA-CRISPR/Cas12a 系统的
(b) 荧光检测 (图 5-a) 和试纸检测 (图 5-b) 均展示出
图 2 荧光检测的特异性分析 了对沙氏弧菌的最低检测限为 100 CFU/mL 的
(a) 荧光检测体系的特异性分析，各组在 LED 灯照射下的荧光照 优异性能，具有和 PCR 金标准检测方法相当的
片 (上排) 和经凝胶成像仪拍摄的荧光照片 (下排)；(b) 荧光检测体 灵敏度 (图 6)。本研究所构建的 2 种基于 RPA-
系的特异性分析，各组相对荧光强度测量结果。NC. 阴性对照组，
CRISPR/Cas12a 系统的可视化检测方法均避免
1. 沙氏弧菌，2. 副溶血性弧菌，3. 溶藻弧菌，4. 哈维氏弧菌，5.
坎氏弧菌，6. 溶珊瑚弧菌，7. 变形假单胞菌； “*”代表组间存在显 了繁琐的凝胶电泳步骤及昂贵的 PCR 仪器，显
著性差异 (P<0.05)，下同。 著简化了检测流程。其中 RPA-CRISPR/Cas12a-
Fig. 2 Specificity analysis of fluorescence detection 试纸检测法更优，无需借助荧光强度测量
LFA
(a) the specificity analysis of the fluorescence detection system, fluores-
设备，这不仅极大缩短了整体检测时长，还有
cence photos of each group under the irradiation of LED light and fluor-
效降低了因荧光背景干扰而可能引发的假阳性
escence photos taken by gel imager; (b) specific analysis of fluorescence
detection system, measurement results of relative fluorescence intensity 风险，从而提升了检测结果的准确性和可靠性。
of each group. NC. the negative control group, 1. V. chagasii, 2. V. para-
2.5 真实样本检测
haemolyticus, 3. V. alginolyticus, 4. V. harveyi, 5, V. campbellii, 6, V.
coralliilyticus, 7. P. aeruginosa; “*” indicates the significant difference
本研究针对 10 份经处理后的真实样本进
(P<0.05), the same below.
行基于 RPA-CRISPR/Cas12a 系统的荧光检测和
相对荧光强度逐渐升高，但当报告探针的浓度 试纸检测。关于荧光检测的实验结果，包括各
为 2.0 μmol/L 时 ， 相 对 荧 光 强 度 达 到 最 大 样本的荧光信号照片 (图 7-a)、经凝胶成像仪拍
(13.63)。继续增加报告探针浓度，相对荧光强 摄的荧光信号照片 (图 7-a) 以及测得各样本的相
度则不再提升。因此，最终选择 2.0 μmol/L 作 对荧光强度的量化柱状图 (图 7-b)，可以明显辨
为荧光检测体系中报告探针的最终优浓度。 识出 1、4、6 和 8 号样本呈现出阳性特征。试
在试纸条检测体系中，报告探针的浓度越 纸检测的结果 (图 7-c) 同样支持了上述发现，1、
大，检测线的背景信号越明显 (图 4-b)。随反应 4、6 和 8 号样本均在试纸上显现了清晰的检测
时间延长，报告探针浓度为 20、30、80 和 100 线 T 信号。鉴于 PCR 检测在核酸检测领域内的
nmol/L 的组别均出现检测线信号，属于假阳结 权威地位，本实验将其作为参照标准，对全部
果。为减少假阳性干扰并确保结果判定的准确 10 份样本进行了 PCR 检验。琼脂糖凝胶电泳的
性，后续实验选择 10 nmol/L 作为试纸条检测体 实验结果显示，1、4、6 和 8 号样本成功扩增
系中报告探针的最优浓度。 出了 toxR 基因条带 (图 7-d)，表明这些样本中

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