Page 214 - 《水产学报》2025年第11期

葛辉，等 水产学报, 2025, 49(11): 119417

表 3 检测方法时间的对比
Tab. 3 Comparison of detection methods time
检测方法 荧光检测法 试纸条检测法 PCR检测法
detection method fluorescence detection method strip test method PCR detection method
总检测时间 ≤1 h ≤1 h ~2 h
total detection time
DNA提取时间 10 min 10 min 10 min
DNA extraction time
扩增时间 RPA扩增 20 min RPA扩增 20 min PCR扩增 ~1 h
amplification time
反应时间 CRISPR/Cas12a反应 20 min CRISPR/Cas12a反应 20 min 凝胶电泳 40 min
reaction time
结果读取时间 荧光读数 ~5 min 试纸条显色 ≤10 min 凝胶成像分析 10 min
result reading time

境。尽管 3 种方法的灵敏度相当 (检测限均为 crRNA，因此 CRISPR/Cas12a 编辑系统在结构
100 CFU/mL)，但荧光检测法和试纸条检测法在 和作用机制方面具有显著优势，被广泛用于病
[46]
快速性、简便性和现场适用性方面更具优势， 原体核酸的检测 。另外，将 CRISPR/Cas 系统
尤其适合水产养殖中的病原快速筛查和防控。 与等温扩增技术相结合，避免了对热循环仪的
依赖，同时也无需琼脂糖凝胶电泳实验的验证，
3 讨论 是简单快速检测病原体的理想工具。一些研究
人员使用 CRISPR/Cas12a 系统结合 RPA 等温扩
弧菌病是导致水产养殖业高死亡率的重要
增技术来检测人瘤病毒 (HPV) 和 B 型脑炎病毒，
疾病之一。沙氏弧菌是一种新发现的弧菌，在
简化了检测过程并缩短了检测时间，同时大大
牡蛎等海洋无脊椎动物中广泛传播，严重制约
提高了检测准确性 。
[47]
养殖业的可持续发展。目前对于沙氏弧菌疾病
本研究基于沙氏弧菌的 toxR 成功构建了基
的防控，早期检测和诊断是预防该疾病暴发和
于 RPA-CRISPR/Cas12a 荧光检测和 LFA 试纸检
流行的关键环节 [41-42] 。目前，PCR 和基于 PCR
测 2 种检测方法，整个检测流程均不超过 1 h。
的技术 (如实时 PCR) 通常用于实验室检测和识
而传统的 PCR 检测方法需要依赖仪器和较长的
别病原体感染。尽管这些技术在实际检测诊断
检测时间 (通常 2 h) 。RPA-CRISPR/Cas12a 荧
[9]
工作中具有一定的优势，但耗时较长 (约 2 h)，
光检测在蓝光下能直观地确定结果，也可以根
且需要依赖昂贵的仪器 。因此，迫切需要一
[43]
据荧光强度的测量确定结果，检测限大约为
种操作简单、灵敏度高、低成本且高度特异性
100 CFU/mL；RPA-CRISPR/Cas12a-LFA 试纸检
的方法来检测牡蛎中的沙氏弧菌感染。 测根据试纸条的显色情况判定结果，检测限同
RPA 等温扩增技术由于其简单性、灵敏性 样为 100 CFU/mL。2 种检测方法的检测结果均
和可靠性，已被广泛设计和改进用于检测各种 与 PCR 金标准的检测结果 具有高度一致性，
[2]
病原体，其扩增过程只需在等温条件下由恒温 可作为沙氏弧菌现场快速检测的有力工具。近
酶驱动 。然而，传统 RPA 检测的结果验证需 年来，基于 CRISPR/Cas 系统的检测方法在病原
[44]
要额外的琼脂糖凝胶电泳实验，大大增加了检 菌检测中展现出巨大潜力，如 Peng 等 [48] 开发
测过程的复杂性 。因此，需要一种直观和简 的 CRISPR/Cas12a 检测体系对金黄色葡萄球菌
[11]
化 的 策 略 来 改 进 RPA 检 测 。 近 年 来 ， 基 于 (Staphylococcus aureus) 的检测限为 10 CFU/mL，
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CRISPR/Cas 系统的核酸检测技术颇受关注，可 检测时间约为 2 h。相比之下，本研究方法进一
以在较短时间内 (约 1 h) 对目标病原体进行超灵 步缩短了检测时间，并实现了荧光和试纸条双
敏和高度特异性的检测，为临床疾病的诊断提 模式检测，更适合现场快速检测。此外，单次
供了新的方案，尤其是对 COVID-19 等流行病 试纸检测的总成本约为 28 元/次，显著低于传
的检测 。在众多的 Cas 蛋白中，Cas12a 具有 统 PCR 检测方法 (约 100 元/次)。在水产养殖中，
[45]
简单的结构和单一启动子，可以同时启动多 快速、低成本的病原检测方法能够帮助养殖户

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