Page 210 - 《水产学报》2025年第11期

葛辉，等 水产学报, 2025, 49(11): 119417

加入灭菌 PBS，在研磨机中进行组织研磨。为 bp M 1 2
了释放细菌核酸，将悬浮液在 95 °C 下加热
2 000
10 min。离心后收集上清液作为处理后的真实
样本，取适量样本进行 RPA 扩增和 CRISPR/ 1 000
Cas12a 检测以及核酸试纸检测。反应结束后， 750
在凝胶成像仪蓝色 LED 的照射下进行目视观察， 500
观察后将溶液置于 96 孔板中，以便使用多功能
酶标仪进行数据的量化。 250
PCR 检测通常被认为是当前核酸检测方法
的金标准，因此，需同时进行相关实验对照验
100
证。具体方法：取待测样本研磨后的上清液
1 μL，PCR 正向引物 1 μL，PCR 反向引物 1 μL，
图 1 沙氏弧菌 RPA 产物和 PCR 产物的
无菌水 10 μL，然后加入 10 μL 的 2×Taq Master
琼脂糖凝胶电泳图
Mix，在 PCR 管中混匀，根据 PCR 仪设置好相
M. DL2000 DNA marker，1. PRA 等温扩增产物，2. PCR 扩增产物。
关参数进行 PCR 扩增，扩增后的样本进行琼脂
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products and
糖凝胶电泳检测，与酶标仪荧光强度的测量结
RPA products of V. chagasii
果和核酸试纸条的显色情况作对比。
M. DL2000 DNA marker, 1. PRA isothermal amplification product, 2.
本研究获得了福建省水产研究所实验动物
PCR amplification product.
管理和使用伦理委员会批准 (FRIF21-2503-01)，
拍摄的荧光信号照片 (图 2-a) 以及各检测组的相
实验过程中操作人员严格遵守福建省水产研究
对荧光强度的量化柱状图 (图 2-b)，上述结果均
所伦理规范，并按照福建省水产研究所伦理委
表明，只有沙氏弧菌样本能够激活 Cas12a 的切
员会制定的规章制度执行。
割活性，产生显著的荧光信号增强。基于 CRISPR/
2 结果 Cas12a 系统的试纸检测法的检测结果同样支持
了上述发现，仅沙氏弧菌组显示出了清晰的检
2.1 引物和 crRNA 的可行性验证 测线 T 信号 (图 3)。值得注意的是，这种特异
性识别源于所设计的 crRNA 序列与沙氏弧菌
实验基于沙氏弧菌的 toxR 基因序列，分别
toxR 基因序列之间的高度匹配性，确保了检测
设 计 了 RPA 引 物 和 PCR 引 物 。 通 过 RPA 和
体系在针对沙氏弧菌检测中的有效性和准确性。
PCR 扩增目的基因，获得了大小分别为 156 和
综上所述，本研究通过荧光检测和试纸条检测
165 bp 的特异性条带 (图 1)，验证了引物的可行
性和特异性。根据设计的 crRNA 位点，利用 2 种方法，从不同角度证实了所构建检测体系
对沙氏弧菌具有高度的特异性识别能力。这种
CRISPR/Cas12a 系统对 RPA 扩增的阳性产物进
特异性不仅体现在显著的荧光信号差异上，也
行检测。荧光法和试纸条法的检测结果均显示
清晰的阳性信号，进一步证实了 crRNA 的有效 通过试纸条检测得到了直观验证，为后续的实
性和检测体系的可靠性。 际应用奠定了可靠的基础。

2.2 特异性分析 2.3 CRISPR/Cas12a 检测反应条件的优化
为了深入评估所构建检测体系的特异性， 首先对荧光检测体系中的报告探针浓度进
实验通过在 PBS 阴性对照 (NC)、沙氏弧菌、副 行了优化。随着报告探针浓度的增加，阳性样
溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、坎氏弧 品和阴性对照组的荧光强度都逐渐升高 (图 4-a)。
菌、溶珊瑚弧菌以及变形假单胞菌的 RPA 扩增 通过计算相对荧光强度 (待测样品荧光强度与阴
样本中均加入靶向 toxR 基因的 crRNA，探究检 性对照组荧光强度平均值的比值)，发现不同探
测体系对目标病原体的特异性识别能力。基于 针浓度 (0.5、1.0、2.0、5.0 和 10.0 μmol/L) 组的
CRISPR/Cas12a 系统的荧光检测结果，生成了 相对荧光强度平均值分别为 6.29、9.41、13.63、
包括 8 组检测的荧光信号照片、经凝胶成像仪 10.68 和 10.12 (图 4-a)。随报告探针浓度增加，

中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
5