Page 207 - 《水产学报》2025年第11期

葛辉，等 水产学报, 2025, 49(11): 119417

(V. parahaemolyticus)、 溶 藻 弧 菌 (V. alginolyti- 活性，导致 Cas12a 蛋白非特异性切割体系内其
cus)、哈维氏弧菌 (V. harveyi) 等弧菌属目前被 他单链 DNA (ssDNA) [25-26] 。基于这一特性，研
认为是养殖鱼类、贝类和虾的病原体 [5-6] 。而沙 究人员设计了由 ssDNA 结合淬灭基团和荧光基
氏弧菌 (V. chagasii) 是最近被确定为患病福建牡 团组成的报告分子，将其与 Cas12a 结合用于病
蛎 (Crassostrea angulata) 等海洋无脊椎动物疾病 原体检测。当靶标存在时，CRISPR/Cas 系统的
[7]
的病原体 ，该菌株在电子显微镜下观察呈短 反式切割活性会释放荧光信号，从而实现高灵
[27]
杆状，使患病幼虫苗体发白，无摄食现象，在 敏度的检测 。近年来，研究人员将 RPA 等温
牡蛎苗种培育过程中出现大规模苗种死亡现象， 扩增技术与 CRISPR 检测相结合，进一步开发
导致水产养殖业遭受重大经济损失。为有效防 出高灵敏度、高特异性的分子诊断方法 [28-30] 。
控弧菌属病原体引发的疾病，建立快速、灵敏 然而，这些方法对荧光检测仪器的依赖性增加
且准确的诊断方法至关重要。这不仅有助于及 了经济和时间成本，限制了其在资源有限环境
时识别病原体，还能为疾病防控提供科学依据， 中的应用。为了克服这一局限，研究人员将
从而减少经济损失，促进水产养殖业的可持续 CRISPR 检测技术与侧向流动分析法 (LFA) 相结
[31]
发展。 合 ，实现了无需复杂仪器，通过肉眼观察即
目前，聚合酶链式反应 (PCR) 和实时荧光 可得到结果的目标，为灵敏、特异且低成本的
定量 PCR (RT-qPCR) 技术是病原体核酸检测的 检测提供了新的可能。LFA 是 1 种基于试纸的
金标准方法，但是这些方法相对耗时，而且对 生物传感器，其结构主要包括 5 个部分：样品
检测条件和设备有较高的要求，限制了其在实 垫、共轭垫、硝酸纤维素膜、PVC 底板和组装
验室以外现场病原体的快速检测 [8-10] 。重组酶聚 在塑料背垫上的吸收垫，可以在 5~30 min 从多
合酶扩增 (RPA) 是一种快速的等温扩增技术， 种样本中快速检测各种分析物 [32-34] 。目前，在
利用重组酶、聚合酶、单链结合蛋白和引物在 CRISPR 检测技术中，常用的横向侧流分析试
37~42 ℃ 的温度范围内扩增 DNA 靶标 [11-13] ，约 纸是由链霉亲和素和能够捕获抗异硫氰酸荧光
素 (FITC) 抗体的金纳米粒子组成，生物素和
[14]
30 min 即可获得目标 DNA 序列 。RPA 等温
扩增技术具有反应条件温和、扩增效率高、设 FITC 分别对单链报告 RNA 的 5′端和 3′端进行
双重标记，通过检测线的显色判定检测结果。
备简单等优点，因此，在细菌、真菌、病毒和
寄生虫的快速检测中被越来越多地应用，尤其 LFA 因其操作简便、灵敏度高、特异性好以及
成本低廉等优点 [35-37] ，在临床诊断、环境监测
适用于现场快检 [15-17] 。然而，这些基于核酸扩
等多个领域均得到了广泛应用。
增的方法只能通过扩增引物结合区域来指示检
基于此，本实验集成了 RPA 和 CRISPR/
测结果，并不能确保扩增序列的准确性。
Cas12a 系统，开发出新型的快速分子检测方法，
近年来，基于 CRISPR 系统的分子诊断方
可同时利用荧光法和试纸法检测沙氏弧菌。
法因其高灵敏度、强特异性等优势，逐渐成为
[18]
现场检测的重要工具 。CRISPR 系统是古细菌 CRISPR/Cas12a 系统可对 RPA 扩增的沙氏弧菌
和细菌的一种天然免疫系统，其核心功能依赖 toxR 基因进行精准识别和切割，并激活反式切
于 CRISPR 相关蛋白 (Cas)。这些蛋白在向导 割活性而裂解报告探针。本研究中使用的报告
RNA 引导下能识别并降解特定的外源性 DNA 探针可兼容荧光法和试纸法检测，二者均表现
序列，从而发挥免疫防御作用 [19-21] 。研究表明， 出高灵敏度和特异性检测沙氏弧菌的潜力，且
Cas 蛋白实际上是一种 RNA 引导的核酸酶，已 试纸法检测 [33] 无需昂贵的实验设备，可在现场
发现的多种 Cas 蛋白如 Cas12a、Cas12b、Cas13a、 部署实现沙氏弧菌的快速即时 (POC) 检测。
Cas13b 和 Cas14 等在分子诊断领域展现出广泛
应用潜力 [22-23] 。在这些 Cas 蛋白中，Cas12a 除 1 材料与方法
了 具 有 CRISPR 衍 生 的 RNA (CRISPR RNA，
1.1 菌株与样品
crRNA) 定向识别和切割特定双链 DNA (dsDNA)
[24]
靶标的功能外，还具有反式切割活性 。crRNA 沙氏弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈
与互补靶序列特异性识别将会触发其反式切割 维氏弧菌、坎氏弧菌 (V. campbellii)、溶珊瑚弧

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