Page 209 - 《水产学报》2025年第11期

葛辉，等 水产学报, 2025, 49(11): 119417

1.5 RPA-CRISPR/Cas12a 荧光检测 打开反应管，将酶切产物稀释 2~20 倍。将试纸
条结合垫 (箭头端) 插入含有酶切产物稀释液
CRISPR/Cas12a 检 测 体 系 (20 μL)： 100
(＞50 μL) 的反应管，液面不得超过结合垫最上
nmol/L Cas12a 蛋 白 10 μL， 荧 光 探 针 0.5 μL，
端，待判读区域全部浸湿，质控线 (C 线) 显色
30 μmol/L crRNA 0.2 μL，5×检测缓冲液 4 μL，
后，将试纸条拿出平放，直接读取检测结果，
扩增样本 5.3 μL，总反应体系为 20 μL。对照组
10 min 内有效，10 min 后判读无效。
将 crRNA 换成超纯水，其余均相同。每个样品
1.7 特异性实验
平行设置 3 组。样本置于 37 ℃ 培养箱中孵育
20 min 后，在凝胶成像仪蓝色 LED 的照射下进 选用沙氏弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、
行目视观察，然后将溶液置于 96 孔板中，以便 哈维氏弧菌、坎氏弧菌、溶珊瑚弧菌以及变形
使用多功能酶标仪进行数据的量化。 假单胞菌 7 种病原菌进行 RPA 扩增，后续分别
进 行 CRISPR/Cas12a 荧 光 检 测 以 及 核 酸 试 纸
1.6 RPA-CRISPR/Cas12a-LFA 试纸检测
检测，以验证 crRNA 对于 CRISPR 检测沙氏
RPA 扩增后的产物经 CRISPR 体系酶切后， 弧菌的特异性。病原菌培养条件见表 2。

表 2 病原菌的培养条件
Tab. 2 Culture conditions of pathogenic bacteria
病原菌 培养基 培养温度/℃ 培养时间/h 培养条件 pH范围
pathogenic bacteria culture medium culture temperature culture time culture conditions pH range
沙氏弧菌 TCBS培养基或2216E液体培养基 28 24~8 振荡培养(150~200 r/min)或静置培养 7.0~8.5
V. chagasii
副溶血性弧菌 TCBS培养基 30 18~24 振荡培养(200 r/min)或静置培养 7.5~8.5
V. parahaemolyticus
溶藻弧菌 TCBS培养基或2216E液体培养基 28 24~48 振荡培养(200 r/min)或静置培养 7.0~8.5
V. alginolyticus
哈维氏弧菌 TCBS培养基或2216E液体培养基 28 24~48 振荡培养(200 r/min)或静置培养 7.0~8.5
V. harveyi
坎氏弧菌 TCBS培养基或2216E液体培养基 28 24~48 振荡培养(150~200 r/min)或静置培养 7.0~8.5
V. campbellii
溶珊瑚弧菌 TCBS培养基或2216E液体培养基 28 24~48 振荡培养(200 r/min)或静置培养 7.0~8.5
V. coralliilyticus
变形假单胞菌 LB培养基 30 18~24 振荡培养(200 r/min)或静置培养 7.0~7.5
P. aeruginosa

1.8 CRISPR/Cas12a 检测反应条件的优化 1.9 灵敏度实验
报告探针是影响 CRISPR/Cas12a 荧光检测 在 28 ℃ 摇床培养沙氏弧菌，制备麦氏浊
和试纸检测的关键因素。荧光检测体系中报告 度约为 0.5 的菌悬液，依次吸取 100 μL 菌悬液
探针浓度的优化：将探针浓度调整为 0.5、1.0、 于 900 μL 磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 中，制成梯度

2.0、 5.0 和 10.0 μmol/L， 通 过 RPA-CRISPR/ 稀释液。同时分别吸取 100 μL 菌液涂布于琼脂
Cas12a系统对浓度为 10 CFU/mL 的沙氏弧菌样 板上，于 28 ℃ 培养 24 h，对不同梯度菌液进
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行计数。最后将提取的 DNA 梯度稀释溶液作为
本进行检测，测量 37 ℃ 孵育 20 min 时的荧光
模板分析 RPA-CRISPR/Cas12a 荧光法以及 LFA
强度。试纸检测体系中报告探针的优化：为避
试纸法的检测限，并将其与 PCR 金标准的检测
免试纸条假阳性，同时提高低浓度模板时试纸
限作对比。
条的显色效果，进行试纸探针浓度的优化。将
50 μL 无酶水中的报告探针终浓度调整为 10、 1.10 真实样本的检测
20、30、80 和 100 nmol/L，充分混匀后，将试 实验从福建省漳州市漳浦县的养殖渔场获
纸条结合垫浸入溶液，记录出现假阳性结果的 得了多个福建牡蛎幼虫真实样本，其中包括健
试纸条报告探针的浓度。 康牡蛎幼虫和患病牡蛎幼虫，对其消毒处理后

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