Page 208 - 《水产学报》2025年第11期

葛辉，等 水产学报, 2025, 49(11): 119417

菌 (V. coralliilyticus)、变形假单胞菌 (Pseudomo- 菌中具有独特的序列特征，能够与其他弧菌 (如
nas plecoglossicida) 7 种病原菌由福建省水产研 副溶血性弧菌、溶藻弧菌等) 区分开来 [38-39] 。此
究所保存。10 份疑似感染沙氏弧菌的临床牡蛎 外，toxR 编码一种重要的转录调控因子，参与
组织样本从福建省漳州市漳浦县的养殖渔场获得。 弧菌的毒力调控和环境适应，是弧菌属中的关
键功能基因 。因此，选择 toxR 基因作为检测
[40]
1.2 主要试剂及仪器
靶点不仅具有分类学意义，还能间接反映菌株
Hi-Yield T7 体外 RNA 合成试剂盒购自哈 的潜在毒力特性。
尔滨新海基因检测有限公司。RPA 等温扩增试 研究基于沙氏弧菌的 toxR 基因序列数据
剂盒购自中智生物科技有限公司。2×Taq Mas- (源自沙氏弧菌基因组数据 GenBank ID: CP1256
ter Mix 试剂盒购自宝生物工程 (大连) 有限公司。 64-CP125668) 比对分析，使用 MEGA 软件对沙
氯化钾、氯化镁、甘油、磷酸二氢钾、十二水 氏弧菌 toxR 基因序列与其他弧菌属的 toxR 基因
合磷酸氢二钠均购自国药集团化学试剂有限公 序列进行多序列比对 (ClustalW 算法)，筛选出
司。琼脂糖购自生工生物工程 (上海) 股份有限 序列一致性≥95% 的高度保守区域，再结合
公司。2216E 液体培养基购自厦门优科新创生 NCBI 的 CDD 数据库，验证保守区域的功能意
物技术有限公司。TCBS 琼脂购自青岛高科技 义，进而筛选出具有高度保守性的序列区域。
工 业 园 海 博 生 物 技 术 有 限 公 司 。 FAM- 研究进一步设计了两组关键的引物序列：一组
TTTATTT (biotin) TATT-BHQ reporte 兼容探针 适用于 RPA 技术的等温扩增正向和反向引物，
(适用 CRISPR 荧光法和胶体金法) 和 Tiosbio ® 另一组则用于传统 PCR 正向和反向引物 (表 1)。
Cas12/13a 专用核酸检测试纸条均购自北京宝盈 此外，实验还设计了 1 个候选的特异性 CRISPR-
同汇生物技术有限公司。本研究所使用的质粒 RNA (crRNA) 模板序列，该序列位于所设计的
(pET28b-Cas12a 质粒) 由南京金斯瑞生物科技有 上游与下游引物之间，具体序列：5'-GUCAAA-
限公司合成，质粒用于制备 Cas12a 蛋白，是 U G A C C A A C C U G C U G C A G A U C U A C A A -
CRISPR/Cas12a 检测系统的核心组件。本研究 GAGUAGAAAUUACCUAU-3'。此 crRNA 模板
所使用的引物和 DNA 序列均由生工生物工程 序列的引入旨在利用 CRISPR/Cas12a 系统的精
(上海) 股份有限公司直接合成。 确性，进一步提高 RPA 或 PCR 扩增的特异性
主要仪器包括 PCR 仪 (Thermo Fisher，美 和灵敏度。
国)、凝胶成像仪 (上海天能生命科学有限公司)、
1.4 RPA 等温扩增
多功能酶标仪 [ 帝肯 (上海) 实验器材有限公司 ]、
振荡培养箱 ZQZY-78AN(上海知楚仪器有限公 RPA 等温扩增的反应体系为 50 μL，反应
司)、纯水机 (Sartorius，德国)、龙方星钰 LF- 步 骤 ： 先 将 RPA 正 反 向 引 物 各 2 μL (0.4
600T 电泳仪 (北京龙方科技有限公司) 等。 μmol/L)、2.5×Rehydration 缓冲液 20 μL 和待测
DNA 模板 5.5 μL 加入装有冻干粉 (1 份) 的检测
1.3 引物和 crRNA 设计
管中，再补水至整个反应体系为 47.5 μL，混合
toxR 基因在弧菌属中高度保守，但其特定 均 匀 后 ， 将 2.5 μL 的 20×Mg (OAc) 加 入 到
2
区域在不同弧菌种间存在差异，可作为种特异 PCR 管盖子上，稍离心混匀后，将混合液放在
性检测的靶点。已有研究表明，toxR 在沙氏弧 39 ℃ 反应 20 min 后得到扩增后的样本产物。

表 1 RPA 引物和 PCR 引物序列
Tab. 1 RPA primer and PCR primer sequences
名称 序列(5′-3′) 扩增目的片段长度/bp
name sequences (5′-3′) amplification target length
toxR-RPA-F TAAAACTGTGCCTAAACGCGGCTACCAATT 165
toxR-RPA-R GTCTCAGAAACGACTTCTTCTGCGACAGGT
toxR-PCR-F TAAAACTGTGCCTAAACGCGG 156
toxR-PCR-R ACGACTTCTTCTGCGACAGG

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