Page 150 - 《水产学报》2025年第5期
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边延欣，等                                                                 水产学报, 2025, 49(5): 059613

              1.5    全鱼和肝脏营养成分测定                               试剂反转录成        cDNA。通过      National Center for
                   水分含量采用       105 °C  烘箱烘干至恒重的方              Biotechnology Information  查找大口黑鲈目的基
                                                               因的   cDNA  序列，使用       Primer 5.0  软件设计特
              法  (GB/T 6435—2014) 测定，粗蛋白质含量采
                                                               异性引物序列，由北京擎科生物科技有限公司
              用凯氏定氮法        (GB/T 6432—2018) 测定，粗脂
              肪 含 量 采 用 石 油 醚 进 行 索 氏 抽 提 法          (GB/T     (长沙) 进行合成，qPCR        引物序列见表       2。β-actin
                                                               作为内参基因，采用            0.5 μL cDNA  与各  0.5 μL
              5009.6—1985) 测定，灰分含量采用              550 °C  灼
                                                                                        ®
              烧至恒重的方法         (GB/T 6433—2006) 测定。             上、下游引物，6 μL Hifair  qPCR SYBR Green

                                                               Master Mix (No Rox) 和  5 μL  无酶水混合，总体
              1.6    生化指标的测定
                                                               积为   12.5 μL。实时荧光定量         PCR  程序设定为
                   生化指标包括血清甘油三酯               (TG)、总胆固         95 °C 30 s；40  个循环   (95 °C，3~10 s；60 °C，
              醇  (TC)、葡萄糖      (GLU)、谷草转氨酶          (GOT)、     10~30 s)；95 °C 15 s，60 °C 60 s，95 °C 15 s。
              谷丙转氨酶        (GPT)、高密度脂蛋白           (HDL-C)、     每个样本     3  个重复，根据     2 −∆∆C t 方法计算目的基
              低密度脂蛋白        (LDL-C)、游离脂肪酸        (NEFA) 和      因相对表达量 。
                                                                           [22]

              碱性磷酸酶       (AKP)，以及肝脏总蛋白           (TP)、甘
                                                               1.10    数据分析
              油三酯     (TG)、总胆固醇        (TC)、肝糖原      (HG)、
              丙酮酸激酶       (PK)，试剂盒均购自南京建成生物                        采用   SPSS 26  软件进行统计学分析，将数
              工程研究所，此外葡萄糖-6-磷酸酶                 (G6Pase) 与     据进行方差齐性检验，满足方差齐性条件则进
              葡萄糖激酶       (GK) 购自上海酶联生物技术有限公                   行单因素方差分析         (One-Way ANOVA)，当差异
              司，所有指标测定步骤和计算公式均严格按照                             显著时    (P<0.05)，采用   Duncan  氏进行事后多重
              说明书进行，所用酶标仪为               SpectraMax ABS  全     比较，方差齐性条件不满足，则用                   Dunnett 氏
              波长酶标仪。                                           T3  检验法进行多重比较。结果用平均值±标准

                                                               误     (mean±SE) 表示。
              1.7    肠道消化酶活性测定
                   肠道组织总蛋白          (TP)、胰蛋白酶       (TPS)、     2    结果
              脂肪酶     (LPS)、淀粉酶     (AMS) 按照相应的说明
                                                               2.1    生长性能及形体指标
              书进行检测，均购自南京建成生物工程研究所，
              所用酶标仪为         SpectraMax ABS  全波长酶标仪                添加牛磺酸后大口黑鲈的                FBW、WGR、
              [ 美谷分子仪器 (上海) 有限公司            ]。                 SGR  均显著上升      (表  3)。与对照组相比，0.05%

                                                               牛磺酸组的      FCR、HSI、VSI 显著下降 (P<0.05)，
              1.8    肝脏组织切片的制备与观察
                                                               0.1%  牛磺酸组的     FCR、HSI、VSI 则呈下降趋
                   肝脏组织用       4%  甲醛固定，经乙醇梯度脱                 势，其他无显著差异。
              水后用石蜡包埋，通过包埋机横向切片制作成
                                                               2.2    鱼体及肝脏成分
              厚度   6 μm  的切片，对肝脏组织切片进行              H.E  染
              色、油红     O  染色和   PAS  染色，切片制作完成后                    大口黑鲈鱼体的水分、粗蛋白、粗脂肪以
              委托武汉塞维尔生物技术有限公司进行白光扫                             及灰分各组间无显著差异             (表  4)，但添加牛磺酸
              描，使用     CaseViewer 2.4.0  软件进行捕获拍照。             后 肝 脏 粗 脂 肪 含 量 显 著 下 降      (P<0.05)， 其 中

                                                               T0.05  组和  T0.1  组的肝脏粗脂肪含量分别下降
              1.9    RNA  提取、反转录及       mRNA  定量分析
                                                               了     22.28%  和  20.73%。
                   用  Trizol 试剂  (翌圣生物科技上海股份有限
                                                               2.3    肝脏组织形态
              公司) 从大口黑鲈肝脏中提取总                RNA，用    1.0%
              变 性 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 其 完 整 性 ， Nano-                添 加 牛 磺 酸 后 肝 脏 糖 原 含 量 显 著 下 降
              Drop2000  (ThermoFisher  Scientific， 美 国 ) 测 定   (P<0.05) (图  1-c)，且  0.1%  牛磺酸组肝脏     TG  水
              RNA  的 纯 度 和 浓 度 。 将 提 取 合 格 的       RNA  用      平显著低于      CON  组  (P<0.05) (图  1-b)，肝脏  TC
                   ®
              Hifair   Ⅲ 1   Strand  cDNA  Synthesis  Kit  (gDNA  水平各组之间无显著差异          (图  1-a)，因此实验选
                         st
              digester plus) (翌圣生物科技上海股份有限公司)                  择对照组与      0.10%  牛磺酸组进行肝脏组织形态
              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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