Page 220 - 《水产学报》2023年第1期

刘绵宇，等 水产学报, 2023, 47(1): 019417

至体长为 3 cm 左右，经过病原 (WSSV、EHP、 个群体的 1-IBS 距离矩阵，估计群体间的遗传距
AHPND、IHHNV、DIV1) 检测后，选择不携带上 离，进一步使用 phylip 软件输出 neighbor-joining
述病原的家系，每个家系随机选择 30 尾个体。为 树文件 [15] ，由 r 包 ggtree 绘制系统进化树 [16] 。利
确保个体感染弧菌，将每个家系测试个体移入带 用 PLINK1.9 计算 3 个群体的期望杂合度 (H )、观
e
有 10 L 海水 (盐度 30、Vp AHPN D 浓度 1×10 cfu/mL) 测杂合度 (H )。基于 Bostein 等给出的公式编写 R
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o
[17]
的塑料小桶中浸浴 15 min 后，模拟实际生产养殖 代码计算多态信息含量 (PIC) 。使用 vcftools 计
[18]
过程中弧菌侵染情况，转移至 100 L 海水 (盐度 30、 算群体间遗传分化系数 (F ) 。采用 Yang 等 [19] 的
st
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Vp AHPN D 浓度 1×10 cfu/mL) 的玻璃钢水槽中养殖。 方法构建了基因组关系矩阵 (GRM)，矩阵内非对
在移入玻璃钢水槽 6 h 后，开始观察个体的存活 角线元素为群体个体间基因组亲缘关系系数。将
情况，每 4 小时观察记录一次，主要记录死亡个 矩阵对角线元素减 1 即为每尾分型个体的基因组
体的家系编号、温度、死亡时间等信息。每 2 天 近交系数。
换水一次，每次换水量 100%，每次换水后添加菌 1.5 遗传参数估计
液使养殖水体内含有 1×10 cfu/mL Vp AHPND 。全部
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个体死亡过半后停止实验。 在本研究中，设置在总体死亡率达到 50% 时
停 止 实 验 。 因 此 将 个 体 的 存 活 状 态 作 为 评 价
1.3 基因型鉴定
AHPND 抗性的表型性状，其中死亡对虾对应的
侵染实验开始 24 h 后开始取样，每隔 4 小时 表型设置为 0，存活对虾对应的表型设置为 1。利
取样一次。为了减少基因型鉴定的样本量，降低 用 R 语言计算不同群体内家系存活率的描述性统
分型成本，且保证样品能够均匀分散在不同的家 计参数，包括最小值、最大值、标准差和变异系
系中，每次每个家系内随机选择一半的死亡个体， 数等。使用 R 包 ggplot2 绘制不同群体内家系存活
取每个对虾的尾部肌肉放入 5 mL 的冻存管中，迅 率的箱型图。
速放入液氮中保存。使用高通量 DNA 提取试剂盒 由于实验中的凡纳滨对虾来源于不同群体，
获取肌肉组织高质量 DNA，利用 GenoBaits探针 遗传和表型性能存在差异，使用包括遗传组效应
的 pBLUP-GG(pBLUP with genetic groups) 模型以
捕获技术构建液相芯片“黄海芯 1 号”45 KSNP
及包括元奠基者的 ssGBLUP-MF (single step gen-
标记的靶向测序文库，使用 MGISEQ-2000 测序平
omic BLUP with Metafounders) 模型估计个体存活
台进行测序。原始测序数据通过生信分析最终获
状态的方差组分。使用两种模型进行分析时，采
得 147 尾对虾的 44 354 个 SNP 标记基因分型信息。
用了 930 尾对虾的存活表型数据，其中包括 784
通 过 PLINK 进 行 质 控 ， 删 除 次 等 位 基 因 频 率
为未分型个体。
(MAF)<0.05 和 SNP 缺失率 >0.1 标记，剔除样本
[20]
利用平均信息约束最大似然 (AIREML) 方法 ，
缺失率 >0.2 的个体，最终保留了 146 尾个体、38 148
结合父母本阈值性状模型 (连接函数 Probit) 通过
个 SNP 标记，其中包括 EE 群体 66 尾、PP 群体
ASReml-R V4.1 包估计凡纳滨对虾存活状态的遗
54 尾、SS 群体 26 尾。
传参数。育种分析模型如下:
1.4 群体遗传背景分析 ½
0; ´ ijk 6 0
y ijk
为了明确奠基者群体间的遗传关系，对 3 个 1; ´ ijk 6 0
群体 146 尾样本进行遗传背景、遗传结构分析并 ´ ijk = ¹ + Sire i + Dam j + e ijk
计算遗传多样性参数。提取 3 个群体的 SNP 信息， 式中, ´ ijk 表示 k 尾虾的存活状态 (0：死亡；1：存
利用 r 包 AGHmatrix 计算得到 G 矩阵后，通过 R 活)， 为 y ijk 的潜在变量，假设其符合累积标准正
语言计算特征向量和特征值，根据特征值计算解 态分布； ¹表示总体均值； Sire i 和 Dam j 表示第 i
释百分比，并在 R 语言中绘制 PCA 图，进行主成 个父本和第 j 个母本的加性遗传效应, Sire和 Dam »
( ) ¡ ¢¡ ¢ ¡ ¢ ¡ ¢
2
2
分分析。利用 admixture 软件对 3 个群体设置 K 值 0,Aσ 2 或 0;H¾ 2 ¾ 2 = ¾ 2 = ¾ ， ¾ 为 父
sd sd sd s d ¹
为 2~5 后进行群体结构分析，使用 r 包 pophelper 本 ( ¾ ) 和母本 ( ¾ ) 加性遗传方差的均值，A 为加
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s d
[14]
包绘制群体遗传结构图 。利用 PLINK1.9 计算 3 性遗传相关矩阵，H 为复合系谱信息和基因组信
中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
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