Page 49 - 《中国医疗器械杂志》2025年第6期
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Chinese Journal of Medical Instrumentation                                         2025年 第49卷 第6期

                                                    综     合     评    述



              含量有限，因此基于此原理的miRNA检测在灵敏                           小RNA、蛋白质和神经递质）的定量检测；近年
              度和特异性方面存在挑战 。                                     来，还有实验室将机器学习与测序技术结合，应用
                                     [2]
               3.1.4    基于RT-qPCR的miRNA检测技术                     于miRNA的研究中       [52-53] 。
                  目前RT-qPCR被认为是miRNA定量的金标准 。                     3.2    新兴miRNA检测技术
                                                          [1]
              其先将miRNA反转录为cDNA，再由cDNA进行                             随着生物技术、材料科学等的发展，近年来出
              PCR反应检测信号值。与常规mRNA样本的RT-                          现了一些原理完全区别于以上传统检测技术的新兴
              qPCR过程不同，miRNA在反转录前需要进行特殊                         miRNA检测技术，包括基于CRISPR-Cas和SERS的
              的加长处理。目前常用的加长方法有加A尾法和茎                            miRNA检测技术。以下是对其基本技术原理的简
                       [44]
              环法两种 ，两种方法均可以用Taq-Man荧光探针                         单介绍。
              法和SYBR green荧光染料法进行后续qPCR检测。                       3.2.1    基于CRISPR-Cas的miRNA检测技术
              虽然RT-qPCR同样存在操作复杂、耗时长等问题，                             CRISPR-Cas是细菌和古菌的一种适应性免疫
              但随着分子生物学技术的发展，qPCR的实验技术                           系统，能够识别并切割入侵的外源核酸（如病
              及配套设备、试剂均得到了广泛普及，基于RT-                            毒、质粒）。该系统主要由CRISPR（成簇规律间
              qPCR的miRNA检测具有很大的应用潜力。                            隔短回文重复序列）和Cas蛋白组成。近年来，
               3.1.5    基于NGS的miRNA检测技术                         由于CRISPR-Cas的特异性结合能力及高效切割活
                  NGS在miRNA的研究中发挥了重要作用。自                        性，Ⅱ类CRISPR-Cas（如Cas9、dCas9、Cas12a、
              2008年以来，能够在几天内并行处理数百万个序列                          Cas13a、Cas14a）成为识别和传递信号的有效工
                                               [45]
              的NGS技术促使大量miRNA被发现 ，目前有大                          具，被广泛应用于多种生物标志物，如核酸、细
                                                                                              [54]
              量 关 于 NGS检 测 miRNA的 研 究        [46-48] 。 NGS检 测   胞外囊泡、酶和金属离子的检测 。不同CRISPR-
              miRNA的步骤与常规RNA的测序过程类似，涉及                          Cas中Cas效应蛋白的导向RNA、靶标类型、切割
              RNA分离、3'和5'端连接接头、反转录和PCR扩                         活性等存在一定差异。其中，Cas12a/13a/14a在导
              增、测序等环节，具体操作因不同的测序平台及原                            向RNA（crRNA）的引导下，对应识别和特异性
              理存在一定差异，但总体来看，与其他高通量方法                            切割靶核酸后，还可以非特异地对周围其他非靶
               如微阵列）相比，NGS技术的优势明显。它不会
             （                                                  标核酸分子进行切割，称为“反式切割（trans-
                                                                           [54]
              受到背景噪声和交叉杂交等问题的影响，可以对样                            cleavage）” 。
              品中的所有miRNA进行全面和确定性的分析                      [41] ，     目前基于CRISPR-Cas的miRNA检测研究大多
              还可以检测未知的miRNA。随着基因组学的不断                           基于反式切割原理：当靶miRNA与crRNA杂交后，
              进步及测序成本的不断降低，基于NGS检测miRNA                         Cas蛋白被激活并非特异性地切割其他核酸分子，
              的技术有望在临床实验室普遍应用。                                  并将切割产生的信号进一步转化为可测量的荧光、
                  近年来，在传统qPCR、测序等技术的基础上，                        比色、电信号等，实现对miRNA的定量检测。例
                                                                           [55]
              衍生出各种快速、高效、准确、更能满足临床应用                            如，LUO等 结合CRISPR-Cas12a构建了一种基于
              需求的检测方法。例如，VANNESS等                  [49] 开发了     荧光信号的miRNA-21检测技术：将发夹状DNA
              基于微流控的数字定量PCR系统，在微流控阵列                            的 3'端 修 饰 FAM基 团 后 ， 固 定 在 金 纳 米 颗 粒
                                                                 AuNP）上。当体系内不含靶miRNA时，FAM基
              平台中整合碱基堆叠PCR和免疫PCR，使用单一                          （
              的生物化学检测方法同时定量miRNA和蛋白靶                            团 的 荧 光 信 号 被 AuNP淬 灭 。 当 体 系 内 含 靶
                           [50]
              标； DENG等 基于恒温扩增PCR的原理，开发                          miRNA时，miRNA与crRNA杂交，Cas12a被激活
              出具有高特异性（单核苷酸分辨率）和灵敏度                              并切割发夹状DNA，FAM从AuNP释放，荧光信号
               femtomolar甚至attomolar水平）的miRNA检测方
             （                                                  恢复并被检测到。该方法不需经过核酸扩增，可以
              法，该方法不仅可以量化临床样本（组织、血清和                            在5 min内对血清中低至10 fM的miRNA-21实现
              血浆）中的miRNA，还可以在单细胞中对miRNA                         高效检出。为进一步提高检测灵敏度，各种核
              进行原位成像；KOCH等 使用基于纳米孔测序原                           酸 扩 增 方 法 如 链 置 换 扩 增 （ strand  displacement
                                     [51]
              理的商用MinION测序设备，在不需要提取或扩增                          amplification, SDA）  [56] 、滚环扩增（rolling circle
              的情况下，直接检测人血清中的心血管疾病相关                             amplification, RCA）  [57] 、催化发夹组装（catalytic
              miRNA，并实现了1小时内对至少40个靶标（如微                         hairpin  assembly,  CHA）  [58] 、 杂 交 链 式 反 应


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