Page 50 - 《中国医疗器械杂志》2025年第6期
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Chinese Journal of Medical Instrumentation                                         2025年 第49卷 第6期

                                                    综     合     评    述



               hybridization  chain  reaction,  HCR）
             （                                  [59] 等 均 可 与    生 局 域 表 面 等 离 子 共 振 （ local  surface  plasmon
              CRISPR-Cas技术结合，用于更低浓度miRNA的检                      resonance, LSPR）效应，自由电子集体振荡，形成
                           [60]
              测。ZHOU等 结合CRISPR/Cas13a构建了一种基                     强烈的局部电磁场。在纳米粒子之间的纳米间隙，
              于 比 色 信 号 的 miR-10b检 测 技 术 ： 目 标 miRNA            即“热点（hot spots）”区域中，拉曼信号可被放大
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              与crRNA杂交后，Cas13a被激活并切割含有核糖核                       10 ~10 倍  [63] 。miRNA分子本身拉曼散射信号弱，
              苷酸尿嘧啶（rU）的前体引物（pre-primer），生                      不易直接探测，因此该技术通过设计特异性探针序
              成带有3'-磷酸末端的断裂前体引物。加入T4多核                          列，使目标miRNA通过碱基互补配对原理与探针
              苷酸激酶（T4 PNK）后，该酶可水解断裂前体引                          结合，引起金属纳米结构与拉曼报告分子状态的变
              物的3'-磷酸基团，产生游离的3'-羟基（3'-OH）末                      化，诱导SERS信号增强或衰减。通过对这种信号
              端。随后，断裂的前体引物与锁式探针（padlock                         变化的监测，可以实现对miRNA的高灵敏度、特
              probe）杂交，启动DNA聚合酶介导的RCA，生成                        异性检测。改变SERS信号有多种方法。有研究利
              富含鸟嘌呤（G）的长串联重复序列。这些富含                             用发夹型捕获探针结构变化影响SERS信号。其基
              G的重复序列能够形成串联G-四联体结构，其可模                           本原理是：当发夹型探针捕获目标miRNA后，发
              拟辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）             夹状态的打开会导致拉曼报告分子靠近或远离金属
              的催化活性，催化ABTS氧化反应并产生可见的                            纳米结构表面，引起SERS信号的改变。基于以上
                                                                              [64]
              颜色变化。该方法可以检出血清或细胞提取物中                             原理，CHEN等 实现了对miR-21的检测，检测限
                                                                                     [65]
                                            [61]
              低至1 fM的miR-10b。BRUCH等 则结合CRISPR/                  低至3.5 fM；KANG等 实现了对MCF-7来源外泌
              Cas13a构 建 了 一 种 基 于 电 化 学 信 号 的 miR-19b           体中let-7a的检测，检测限低至5.3 aM。还有研究
              检测技术：在微流控通道内，标记有6-FAM荧光基                          通过纳米粒子聚集状态变化影响SERS信号。例如
              团和生物素的报告RNA通过生物素固定于固相表                            WU等   [66] 构 建 了 两 种 纳 米 粒 子 ： 外 层 包 覆 Ag的
              面，并与葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, Gox）标                 Fe O @Ag磁性粒子表面修饰与目标miRNA一端互
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              记的抗荧光素抗体结合。当目标miRNA与crRNA杂                        补的ssDNA，金纳米粒子表面则修饰拉曼报告分子
              交后，Cas13a被激活并切割报告RNA，导致Gox从                       以及与目标miRNA另一端互补的ssDNA。样本中
              固相表面解离。随后，注入反应体系的葡萄糖溶液                            的目标miRNA与Fe O @Ag磁性粒子结合并被磁性
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              被残留的Gox催化，产生大量过氧化氢（H O ）。                         分离后，引入修饰拉曼报告分子的金纳米粒子，目
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              H O 流经工作电极表面，产生可检测的电流信号。                          标miRNA使两类纳米粒子结合，形成聚集体局
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              该方法可以检出血清中低至10 pM的miR-19b。                        域热点，拉曼信号增强。该方法针对3种目标
               3.2.2    基于SERS的miRNA检测技术                        miRNA分别设计了与其互补的ssDNA，并引入3种
                  表 面 增 强 拉 曼 光 谱 术 （ surface-enhanced          不同的拉曼报告分子（罗丹明6G、结晶紫、4-氨基
              Raman spectroscopy, SERS）是一种基于拉曼光谱                硫 酚 ） ， 检 测 血 清 中 的 miR-21、 miR-122和 miR-
              的增强技术，它利用等离子体金属纳米结构的独特                            223，检测限分别为311、349 和374 aM。
              光学性质，显著增强邻近分子的拉曼散射信号，从                                CRISPR-Cas与SERS技术在体外诊断领域的应
              而实现对低浓度甚至单分子水平物质，包括DNA、RNA、                       用均展现出显著的技术优势，包括样品预处理流程
                                                    [62]
              蛋白质、细菌、病毒、小RNA等的检测 。基于                            简化、无扩增依赖性、检测周期缩短、超灵敏检测
              SERS技术检测的核心组件包括用于信号增强的金                           能力（fM甚至aM级）、分子识别特异性增强以及
              属纳米结构（如金、银）、用于特异性识别目标分                            多模态检测能力等。尽管当前两种技术的操作复杂
              子的捕获探针（如ssDNA、抗体）以及用作“信号                          度较高且规模化生产成本尚需优化，但其在临床转
              标签”的拉曼报告分子（如罗丹明6G）。拉曼报                            化层面的突破性潜力仍备受瞩目。
              告分子具有独特的拉曼指纹图谱，其振动模式可被                             4    miRNA应用于体外诊断的现状与挑战
              金属纳米结构显著增强，从而将生物识别信号转化
              为可检测的SERS信号。SERS信号增强机制主要分                             miRNA作为生物标志物在体外诊断领域的应
                                       [62]
              为化学增强和电磁增强两种 。                                    用备受关注。一方面，miRNA在转录后翻译中的
                  目前基于SERS检测miRNA的技术主要依赖于                       重要调节作用，以及其作为生物标志物的巨大潜力
              电磁增强机制：当激发光照射金属纳米结构时，产                            已经被广泛报道；另一方面，可用于miRNA检测


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