Page 82 - 《中国药科大学学报》2026年第2期
P. 82

208                      学报   Journal of China Pharmaceutical University 2026, 57(2): 206 − 214  第 57 卷

               有限责任公司）；激光粒径测定仪、Avance AV-                        2.3    LL-PTP/ZnPc 的制备与表征
               500 型 核 磁 共 振 仪 （ 瑞 士     Bruker 公 司 ） ； FT-IR        通 过 透 析 法 用 合 成 的    LL-PTP  偶 联 物 包 封
               Nicolet Impact 410 型红外光谱仪（美国         Nicolet 公   ZnPc。精确称量冻干的           LL-PTP 27 mg，将其加入
               司）；LS-2010CHT    高效液相色谱仪、RF5301PC          荧     纯水   4.5 mL  中并重新溶解，缓慢加入质量浓度为
               光分光光度计（日本岛津公司）；LSM700 激光共聚                       3 mg/mL ZnPc 的  N-甲基吡咯烷酮溶液          1.8 mL，用
               焦显微镜（德国       Zeiss 公司）；MACSQuant 流式细胞           3 500 MWCO  透析袋透析，得到         LL-PTP/ZnPc 纳米
               仪（德国美天旎公司）；IX53 倒置显微镜（日本奥林                       粒溶液，冷冻干燥得到           LL-PTP/ZnPc 纳米粒。通过
               巴斯公司）。                                           相同的方法制得        LL/ZnPc 纳米粒。此外，通过          UV-
                1.3    细 胞                                      Vis 分 别 检 测 了   ZnPc 的 载 药 量 和 包 封 率 。 LL-
                    人源胰腺导管腺癌细胞株             PANC-1，由中国药         PTP/ZnPc 的 粒 径 和   Zeta 电 位 通 过 动 态 光 散 射
               科大学新药安全评价研究中心提供。PANC-1 细胞                        （DLS）仪测量。此外，通过          DLS  研究了不同负载水
               在添加了     10%  胎牛血清（FBS）和       1%  青霉素/链霉        平的   ZnPc 对纳米粒粒径的影响，以探索               ZnPc 和
               素的   DMEM   培养基中在      37 ℃、含   5%CO 条件下
                                                     2
                                                                LL-PTP  之间的相互作用。扫描           LL-PTP/ZnPc 的紫
               培养。
                                                                外吸收光谱和荧光发射光谱，以研究                   ZnPc 在  LL-
                2    方 法                                        PTP/ZnPc 中的堆叠方法。
                                                                 2.4    体外药物释放研究
                2.1    炔基化  LND  的合成
                                                                     通过分别向血清和肿瘤组织匀浆中添加                    LL-
                    将  LND（0.16 mmol）溶于二氯甲烷，加入氯化
                                                                PTP/ZnPc，研究了     LL-PTP/ZnPc 的释放行为。在
               亚砜（0.78 mmol），室温反应       3 h，减压蒸馏除去溶剂
                                                                12、24 和  48 h 通过  HPLC  测量   LND  含量，并在每
               及过量的氯化亚砜，得到白色固体，收率为                   99%。
                                                                个时刻计算血清和肿瘤组织匀浆中的游离                    LND  含
                    取上一步新合成的产物溶于二氯甲烷，0 ℃                  下
                                                                量。此外，称取等量的          LL-PTP/ZnPc，分别溶解在含
               加入三乙胺（0.25 mmol）、炔丙醇（0.25 mmol），室温
                                                                有  1%  吐温  80 的血清或肿瘤匀浆中。通过荧光分
               反应   2 h，减压蒸馏除去溶剂，用乙酸乙酯萃取，饱
                                                                光光度计在      12、24 和  48 h 测量  ZnPc 的含量，并计
               和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后减压蒸馏
                                                                算释放百分比。
               得淡黄色固体粗品，柱色谱纯化（PE-EA，10∶1），得
                                                                 2.5    细胞摄取行为
               淡黄色油状物，收率为          89%。
                                                                     为了评估细胞摄取，将对数生长期               PANC-1 细
                2.2    LL-PTP  偶联物的合成与表征
                                                                胞接种在共聚焦培养皿中孵育                 24 h。加入游离
                    LL-PTP  偶联物由    LMWH、LND     和  PTP  制备。
                                                                ZnPc 溶液、LL/ZnPc 溶液和       LL-PTP/ZnPc 溶液并
               首先参考文献方法          [12]  合成了叠氮  LMWH   和  PTP-
                                                                孵育   12 h。竞争抑制组用       20 mmol/L PTP  溶液孵育
               LMWH-N 。然后，将        PTP-LMWH-N 溶解在甲酰
                                                3
                        3
               胺中，加入炔基化         LND、五水硫酸铜和抗坏血酸。                 1 h，然后用    LL-PTP/ZnPc 溶液孵育     12 h。用  4%  多
               在室温下反应        24 h，将反应溶液倒入冷丙酮中，然                 聚甲醛溶液固定        20 min，并使用激光共聚焦显微镜
               后在−20 ℃    下放置   0.5 h，产生白色沉淀。随后，进行              （CLSM）进行观察。
               3 000 r/min 离心  5 min，丢弃上清液。沉淀物用纯                     对于定量分析，对数生长期            PANC-1 细胞以每
                                                                       5
               化水重新溶解，用          3 500 MWCO  透析袋透析并冻            孔  1×10 个细胞的密度接种在           24 孔板中，并在培
               干 ， 得 到 白 色 絮 状 固 体     LL-PTP  偶 联 物 。 称 取      养箱中孵育       24 h。然后将细胞与游离           ZnPc、LL/
               LMWH-N 加入甲酰胺中，重复上述步骤，得到                 LND-     ZnPc 和  LL-PTP/ZnPc 溶液孵育     12 h。竞争抑制组
                        3
                                                     1
               LMWH（LL）偶联物。LL-PTP         偶联物通过 H NMR           与  20 mmol/L PTP  溶液孵育     1 h，与  LL-PTP/ZnPc
               和  FT-IR  方法进行验证。通过紫外分光光度法测                      溶 液 孵 育   12  h。 胰 蛋 白 酶 消 化 细 胞 ， 离 心 ， 用
               定  LL-PTP  中  LND  的取代度（DS）。选择         Zeta 电    MACSQuant 流式细胞术测量每组的荧光强度。
               位和粒度分析仪来表征             LL-PTP  偶联物的粒径和            2.6    体外  PDT  效率和细胞毒性试验
               Zeta 电位。选择芘作为探针，用荧光分光光度计测                             为了初步评估       LL-PTP/ZnPc 的  PDT  效率，将
                                                                                       4
               定  LL-PTP  偶联物的临界聚集浓度（CAC）。                      PANC-1 细胞以每孔       3×10 个细胞的密度接种在          24
   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87