Page 25 - 《中国药科大学学报》2026年第2期

第 57 卷第 2 期 尹莹莹，等：链霉菌细胞色素 P450 酶的功能及改造和应用 151

物 ，其惰性 C−H 键的选择性羟基化是其功能化的 酶或细胞。通过蛋白质工程改造酶蛋白，使其能够
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重要反应之一。链霉菌来源的多种 P450 酶均展示 高效利用辅因子，是提高 NAD(P)H 偶联效率的有
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了对类固醇化合物良好的选择性羟基化活性 。 效方法 。此外，将 P450 单加氧酶改造为过氧化
OleP 催化石胆酸 (lithocholic acid，LCA) 的 6β 位羟 酶模式，也是推动 P450 酶工业化应用的理想方
基化生成鼠去氧胆酸 (murideoxycholic acid，MDCA)， 案。丛志奇教授团队首先通过“双功能小分子策
而对 7β 位无选择性，无法生成临床上用于治疗胆 略”实现了 P450 酶对 H O 的利用。在此基础上，
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汁性疾病的关键药物熊去氧胆酸 (ursodeoxycholic 通过对“H O 隧道工程”相关残基的理性设计，为
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acid，UDCA)。研究团队首先通过结构分析与分子 H O 的输送提供最优路径。同时，通过理性设计，
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对接，确定 LCA 与 OleP 对接构象中距离血红素 将对 H O 敏感的残基突变为耐受残基的“氧化还
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5~14 Å的 24 个活性位点残基，随后通过丙氨酸扫 原敏感残基工程”则成功解锁 P450 酶的过氧化物
描 突 变 确 定 关 键 残 基 ， 基 于 P450 单 加 氧 酶 的 酶 功 能 ， 该 组 合 策 略 已 成 功 应 用 于 P450 BM 3 和
3DM(3-Dimensional Multiple Alignment) 数据库指 CYP199A4、CYP153A q 酶的改造 。
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M.a
导构建“小而精”的突变体库，同时利用高通量筛选 P450 酶因其出色的催化性能，而展现出巨大
方法进行检测，最终得到的三重突变体实现了对底 的工业化应用潜力。通过对 P450 酶的针对性改造，
物 LCA 高选择性的 7β-羟基化 。但该三重突变 实际应用的多种限制性问题有望得到解决：（1）通
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体催化效率低，且在全细胞催化系统中，LCA 会对 过改造 P450 酶，可提高其催化活性、稳定性或改变
细胞造成损伤，从而限制工业化应用。以此三重突 选 择 性 ； （ 2） 通 过 改 造 P450 酶 ， 可 提 高 辅 因 子
变体为模板，首先通过底物结合口袋分析筛选突变 NAD(P)H 的偶联效率，优化电子传递效率，也可直
位点，再通过丙氨酸扫描突变、饱和突变及多轮组 接改造为过氧化酶模式，实现降本增效。
合突变优化催化活性与选择性，所获取的四重突变 3.2 基于体系优化的改造策略
体的细胞游离酶系统产率和选择性分别提升至 适配的还原伴侣蛋白对 P450 酶活性发挥至关
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68.43% 和 90.05% 。 重要。OleP 酶可催化 LCA 的 6β 位羟基化生成高
另一方面，通过改造 P450 酶蛋白的底物识别 价值的 MDCA，但转化率仅为 19.5%，低电子传递
位点，以获取新颖结构或更高稳定性的化合物，也 效率是导致反应低活性的关键因素。王斌举教授
具备良好的应用前景。Streptomyces sp.SN-593 来 团队通过构建伴侣蛋白库和伴侣蛋白的半理性设
源的具有独特螺缩醛核心结构的抗生素瑞维霉素 计两步举措，使最终的 OleP–PetF F64 D 组合的全细胞
A(reveromycin A，RM-A) 具有广泛的生物学活性， 转化率提升至 80.9%。该团队首先通过筛选和检
但其在酸性条件下不稳定，限制了其临床应用。 测，确认 OleP 最优的还原伴侣系统。在此基础上，
P450 rev l 催 化 RM-A 生 物 合 成 中 间 体 瑞 维 霉 素 进一步通过蛋白结构分析筛选还原伴侣蛋白突变
T(reveromycin T，RM-T) 的 C18 位羟基化。通过比 位点，结合开发的高通量筛选方法进行检测，最终
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对野生型和突变体（预测可能催化 C16 或 C17 羟基 获取最理想的突变体 。
化）P450 l 与底物 RM-T 的共晶结构，对潜在的突 P450 酶催化反应依赖昂贵的辅因子 NAD(P)
rev
变靶点进行理性设计，获得的 A241L 突变体成功产 H，限制了 P450 酶的工业化应用，常通过酶促、化
生了对酸稳定性增强的 C17 位羟基化的新型瑞维 学、光催化和电化学等方法实现 NAD(P)H 的再
霉素衍生物 。除了常规的蛋白质诱变外，有研究 生。全细胞催化体系中，常通过代谢工程强化磷酸
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人员独辟蹊径，通过对 PikC 进行非天然氨基酸介 戊糖途径，过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以实现
导的半理性设计得到了突变体 PikC H238pAcF ，利用该 NAD(P)H 的供应。细胞游离酶体系对应的辅因子
突变体与糖基转移酶的体外酶级联反应，科研团队 再生方法相对更多。以酶促再生方案为例，工业生
成功获取了多种非天然大环内酯类化合物 。 产中广泛用于辅因子再生的酶包括甲酸脱氢酶和
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P450 酶催化循环过程中，NAD(P)H 到 P450 酶 葡萄糖脱氢酶，而磷酸盐脱氢酶、醇脱氢酶和葡萄
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的亚铁血红素中心需历经复杂的电子传递，NAD(P)H 糖-6-磷酸脱氢酶则被大量用于实验室研究 。相
的解偶联不仅会造成浪费，还会产生活性氧，损害 较于其他再生方法，光催化辅因子再生 [51] 的核心优