Page 142 - 《中国药科大学学报》2026年第2期
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               检测试剂盒       (南京珩益生物科技有限公司)；CD31                  工作台中取出脐带样本，并将其置于一个含有少量
               抗体   (武汉赛维尔生物科技有限公司)；流式抗体                        PBS  的培养皿中，将其剪成长度            2~3 cm  的小段，利
               CD29、CD73（美国      BD Biosciences 公司）；流式抗         用无菌眼科剪刀和镊子小心地从脐带中分离出残
               体  CD140a、CD31、CD45（美国        Biolegend 公司）；     留的动脉和静脉血管。然后继续使用无菌眼科剪
               Alexa Fluor 488 荧光二抗（武汉爱博泰克生物科技                  刀将脐带剪碎成均匀的碎块，随后将碎块均匀铺于
               有限公司）。                                           T25 培养瓶，加入完全培养基后于               37 ℃、5% CO   2
                1.2    仪 器                                      培养箱中培养。每          3 天换  1 次液，待    hUCMSCs 爬
                    多功能冷冻离心机（日立            Hitachi 公司）；倒置       出并融合至一定密度后移去组织块，使用                   0.25%  胰
               荧 光 显 微 镜 、 TS2R    显 微 图 像 采 集 系 统 （ 日 本        蛋白酶消化，镜下观察细胞形态收缩变圆后立即加
               Olympus 公 司 ） ； 流 式 细 胞 仪 （ 美 国    BD  公 司 ） ；   入  FBS  终止反应。将细胞悬液离心，除上清液，重
               Synergy 2 酶标仪（美国     BioTek 公司）。                 悬细胞后置入新的           T25 培养瓶中，得到第一代
                1.3    动 物                                      hUCMSCs。当细胞长至          80%~90%  进行细胞传代
                    25 只  6~8 周龄，体重约     25 g 的雄性    C57BL/6    培养。取      P3 代的  hUCMSCs，采用流式细胞仪检
               小鼠，购自扬州大学模式动物研究所，许可证号：                           测  hUCMSCs 表面标志物        CD29、CD73、CD140a、
               SCXK（苏）2022-0009。所有实验动物均饲养于中                     CD31、CD45 的阳性率。
               国药科大学       SPF  级动物实验中心，饲养条件如下：                  2.3    hUCMSCs 的成脂、成骨、成软骨诱导分化
               温度维持在（23±2） °C，相对湿度控制在（55±5） %，                       将  P3 代  hUCMSCs 以适宜密度接种于六孔
               采用   12 h 光照/12 h 黑暗的交替更换制度。在饲养                  板，待细胞长满后，弃去原培养基，然后加入相应的
               期间，小鼠可自由获取饲料和水，垫料每                   3 天更换       成脂、成骨、成软骨诱导分化培养基进行定向诱导
               1 次，以维持饲养环境的清洁。实验中对动物的处                          培养，每    2 天换   1 次液，持续培养约        21 d。诱导结
               理均符合动物伦理学要求，并经中国药科大学实验                           束后，分别采用油红         O、茜素红、阿尔辛蓝染色评估
               伦理委员会批准（批准号：2024-09-019）。                        细胞的成脂、成骨、成软骨的分化能力。
                1.4    菌株和细胞                                     2.4    糖尿病创面小鼠模型构建
                    链状粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）、嗜            随机选取     5 只小鼠，设为空白对照组，并以常
               黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）、脱硫             规饲料和普通用水进行喂养。其余小鼠连续                       5 日
               脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）和粪肠球菌           以  50 mg/kg 的剂量腹腔注射       STZ，注射   1 周后测量
               （Enterococcus faecalis）均由南京明基医院提供。               小鼠的空腹血糖值。当血糖值大于                   11.1 mmol/L，
                    hUCMSCs 由江苏细胞科技医疗研究有限公司                     且血糖水平持续         2 周时，即可判定为糖尿病小鼠。
               提供。该产品在中国临床试验中心注册和审核（注                           随后，将小鼠置于小动物面罩内，异氟烷吸入麻醉，
               册号：ChiCTR2000031494） 。                           去除小鼠背部毛发，依次使用               0.9%  氯化钠溶液和
                                       [17]
                                                                碘伏进行清洗和消毒，最后在小鼠背部皮肤上标记
                2    方 法
                                                                一个直径为      1 cm  的圆形区域，并沿着该标记切除
                2.1    益生菌混合溶液的制备                               皮肤全层即可构建糖尿病创面小鼠模型。
                    将  4 种菌株冻干粉重悬在生理盐水中，将各菌                      2.5    动物分组及给药
               悬液按照     1∶1∶1∶1 比例混合后制备成          2×10  CFU/         将  25 只  C57BL/6 小鼠随机分为        5 组，每组
                                                      10
               200 μL  的益生菌混合溶液。                                5 只。具体分组情况如下：空白对照组（Control）：未
                2.2    hUCMSCs 的分离和鉴定                           接受任何实验性治疗；模型组（DF）：未接受任何实
                    在获得孕妇的同意后，采集足月出生的健康新                        验性治疗；hUCMSCs 治疗组（hUCMSCs）：于造模
               生儿的脐带。首先，使用无菌生理盐水彻底清洗以                           后第   0 天进行单次细胞注射。将            P3 代、生长状态
               去除残留的血液，然后对脐带的两端进行结扎处                            良好的    hUCMSCs 用生理盐水重悬，调整细胞浓度
               理，并将其置于经高压灭菌的含有                5%  青霉素-链霉        为  1×10  cells/400 μL [18−20] 。使用胰岛素注射器，于
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               素的   PBS  中。完成所有无菌操作准备之后，从超净                     创缘周围约      2 mm  处进行皮内注射。注射时，针头
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