Page 143 - 《中国药科大学学报》2026年第2期

第 57 卷第 2 期 靳倩倩，等：人脐带源间充质干细胞联合肠道益生菌促进糖尿病小鼠创面愈合 269

与皮肤呈约 10 度角刺入，深度约 1~2 mm，以确保 10 min；滴加 DAPI 染核，封片。通过荧光显微镜观
细胞被输送至真皮层。注射分为 8 个点，每点注射 察小鼠伤口组织 CD31 阳性表达可间接表征血管生
50 μL；益生菌治疗组（Probiotics）：于造模后第 0 天 成情况，采用 Image J 软件计算单个视野新生血管
起，每天灌胃益生菌混合溶液 200 μL；hUCMSCs 联 面积。
合益生菌治疗组（hUCMSCs+probiotics）：同时接受 2.5.4 免疫组化检测小鼠伤口组织 Collagen I 阳性
2
hUCMSCs 治疗与益生菌干预，细胞注射方案同 表达 切片经脱蜡复水、抗原修复、3% H O 处
2
hUCMSCs 组，益生菌灌胃方案同益生菌组。 理、封闭后，滴加抗 Collagen I 一抗（1∶200），4 °C 孵
2.5.1 创面愈合情况 于造模后第 0、3、6、9、 育过夜；PBS 洗 3 次，每次 5~10 min；滴加 HRP 标
12 天对创面进行拍照记录，并采用 Image J 软件对 记的二抗，室温孵育 1 h。孵育结束后使用 DAB 显
创面面积进行分析测量，计算伤口愈合率以评估伤 色液进行显色，苏木精复染细胞核。染色完成后，
口的愈合程度，伤口愈合率（%）=（伤口初始面积−伤 切片经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，最后用中性树
胶封固。于光学显微镜下随机采集 5 个不重叠视
口剩余面积）/伤口初始面积×100。
野的图像，并利用 Image J 软件定量评估 Collagen
2.5.2 HE 和 Masson 染色观察小鼠伤口组织病理
I 阳性区域的平均光密度值。
情况 于造模后第 12 天颈椎脱臼处死小鼠，取创
2.5.5 ELISA 检测 Arg1、IL-6、IL-1β、TNF-α 的
面皮肤组织，用 4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋组织。
表达水平 称取伤口愈合组织约 30 mg，按 1∶9 的
将包埋的蜡块制成 4 μm 厚度的切片。
比例加入适量 PBS，在冰上匀浆后，离心获得组织
HE 染色 通过 HE 染色评估创面的再上皮
匀浆液。按照 ELISA 试剂盒说明书步骤检测小鼠
化程度。切片首先经由二甲苯逐步脱蜡，再经乙醇
伤口组织 Arg1、IL-6、IL-1β、TNF-α 的表达水平。
梯度复水。随后，切片经苏木精染色、流水冲洗后，
同时采取各组小鼠的血清，采用 ELISA 检测小鼠血
5% 乙酸分化，再用伊红染液复染胞质。染色完成
清中 Arg1、IL-6、IL-1β、TNF-α 的表达水平。
后，切片经乙醇梯度脱水，二甲苯透明，最后用中性
2.6 统计学方法
树胶封固，镜下观察记录并室温保存。
实验所得数据均使用 SPSS v18.0 统计软件进
Masson 染色 通过 Masson 染色评估创面
行数据处理。实验数据以均数±标准差（ x±s）表示，
组织中胶原沉积的情况。切片经蒸馏水浸润后，首
采用 GraphPad Prism 8 统计软件对实验数据进行统
先进行胞核染色并使用蒸馏水充分漂洗。随后滴 计和分析。两组间的比较使用配对 t 检验和单因素
加丽春红酸性品红染液，于室温染色 5~10 min；用
方差分析，P 值大小表示统计学差异，P<0.05 表示
1 % 冰醋酸水溶液漂洗后，滴加磷钼酸水溶液室温 差异具有统计学意义。
孵育 5~10 min 进行分化处理；再用苯胺蓝复染 5
3 结 果
min，并用乙醇洗净。待切片干燥后，中性树胶封
固。镜下观察记录并室温保存。 3.1 hUCMSCs 的流式鉴定结果
2.5.3 免疫荧光检测小鼠伤口组织 CD31 阳性表达 采用流式细胞术对 P3 代 hUCMSCs 的表面
切片经过脱蜡复水、抗原修复、封闭后，滴加抗 抗原表达情况进行检测，结果显示：细胞均一性
CD31 一抗（1∶200），于 4 ℃ 孵育过夜；PBS 洗 3 高 表 达 间 充 质 干 细 胞 表 面 标 志 CD29、 CD73、
次，每次 5~10 min；滴加 Alexa Fluor 488 荧光二抗 CD140a，而不表达造血干细胞表面标志 CD45 和
（1∶200），室温避光孵育 1 h；PBS 洗 3 次，每次 5~ CD31（图 1）。

120 120 120
100 120
90 80 90 90 90
Count 60 Count 60 Count 60 Count 60 Count 60
40
30 30 30 30
20
0 0 0 0 0
4
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 0 10 1 10 2 10 3 10 10 5 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5
PerCP-Cy5.5-CD29 PE-CD73 APC-CD140a PE-CD45 PE-CD31
Figure 1 Flow cytometry detection of surface markers of hUCMSCs