Page 76 - 《中国药科大学学报》2026年第1期
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               限公司）；Feyond-A300 多功能酶标仪（杭州奥盛仪                    后，实验组分别加入含           2、4、6 μmol/L  五氟利多的
               器有限公司）；BZ-X800E        荧光倒置显微镜        [ 基恩士      培养基，孵育      48 h。之后每    2 天换液一次，继续培养
               （中国）有限公司        ]；5702R  台式低温离心机（德国              15 d。细胞形成集落后，每孔加固定液               700 μL，固定
               Eppendorf 公司）；FACSCanto II 流式细胞仪（美国              15 min（室温）。PBS    洗两次，加     1%  结晶紫   1 mL  进
               BD  公司）；PowerPac HC   高电流电泳仪、电泳槽、小               行染色    10 min，PBS  洗去染液。孔板风干后拍照。
               型转膜仪（美国       Bio-Rad 公司）；BioSpectrum 310 生       2.4    细胞周期检测
               物光谱成像系统（美国          UVP  公司）；Octet K2 生物分             将  A375、B16 细胞接种于       6 孔板，贴壁     12 h
               子互作分析仪（美国 Fortebio 公司）。                          后加入含不同浓度五氟利多的培养基。孵育                       24 h
                1.3    细 胞                                      后，弃上清液，消化收集细胞。加入预冷的                    70%  乙
                    人黑色素瘤细胞         A375，小鼠黑色素瘤细胞               醇  500 μL，在  4 ℃  下固定   4 h。离心弃乙醇，PBS
               B16 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。上述细胞                         洗，离心后弃上清液。加入              RNaseA  溶液   100 μL，
               株均经短串联重复序列（short tandem repeat，STR）              37 ℃  水浴  30 min。每管加      PI 染液  400 μL，混匀，
               鉴定确认，无交叉污染。                                      4 ℃  避光孵育    30 min。流式细胞仪检测分析。
                1.4    动 物                                       2.5    Hoechst 33342 实验
                    C57BL/6J 小鼠，雄性，体重（22 ± 2）g，4 周龄，                 将  A375、B16 细胞接种至       6 孔板，贴壁     12 h
               购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号：                           后加入不同浓度五氟利多。孵育               24 h 后，每孔加    4%
               SCXK(鲁)2024-0006。小鼠饲养于滨州医学院               SPF    固定液     1 mL，室温固定      10 min。PBS   冲洗   2 次，
               级动物房，12 h/12 h 明暗交替照明，自由饮水。所                     每 次  3  min。 加  Hoechst  33342 染 色 液 （ 2  μg/mL）
               有动物实验均符合滨州医学院动物伦理委员会标                            500 μL，室温染色      10 min，PBS  冲洗。荧光显微镜
               准（动研批第      2024-045 号）。                         观察细胞核形态及荧光强度。
                                                                 2.6    Annexin V-FITC/PI 双染
                2    方 法
                                                                     将  A375、B16 细胞按照每孔       2.5×10 个细胞接
                                                                                                    5
                2.1    细胞培养                                     种于   6 孔板，贴壁     12 h 后加入不同浓度五氟利多。
                    黑色素瘤     A375 细胞在含      10%FBS、1%   青霉      孵育   24 h 后，弃上清液，消化收集细胞。用预冷的
               素-链霉素及      1%  丙酮酸钠的     DMEM   完全培养基中          1×Annexin V  结合缓冲液      100 μL  重悬细胞，加入
               培养；黑色素瘤        B16 细胞在含     10% FBS、1%   青霉      Annexin V-FITC  和  PI 染色剂  5 μL，混匀，低温避光
               素-链霉素的      RPMI-1640 完全培养基中培养。两者                孵育   15 min。每管加入预冷的          1×结合缓冲液      400
               均于   37 ℃、5% CO 培养箱中培养至细胞密度达                     μL，混匀，流式细胞仪检测。
                                 2
               70%~80%  时用于实验。                                   2.7    Western blot 实验
                2.2    MTT  实验检测细胞增殖                                 A375、B16 细胞经不同浓度五氟利多处理后，
                    取 对 数 生 长 期    A375、 B16 细 胞 以 每 毫 升        用  RIPA  裂解液提取蛋白，BCA        法测定浓度并调整
                   3
               8×10 个细胞，每孔      200 μL  接种于  96 孔板，培养    12 h   至  6 μg/μL。进行    SDS-PAGE  电泳（90 V，30 min；
               后分空白对照组、正常细胞对照组和实验组，每组                           120 V，1 h），转膜（210 mA，120 min）。5%     脱脂牛奶
               3 个复孔。空白对照组和正常细胞对照组加入完全                          室温封闭     3 h，TBST  洗膜。加入一抗        4 ℃  孵育过
               培养基    200 μL，实验组加入含        1~10 μmol/L  五氟利     夜，TBST   洗膜。加入二抗室温孵育             40 min，TBST
               多的培养基（终体积         200 μL）。继续培养      24 h 后，每     洗膜。凝胶成像系统显影分析蛋白条带。
               孔加   MTT  溶液（5 mg/mL）20 μL。2 h 后弃上清液，             2.8    五氟利多-HSP76 分子对接分析
               每孔加     DMSO 150 μL，振荡     10 min。酶标仪     490         从蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）
               nm  测吸收度（A）。计算抑制率：抑制率=(正常细胞                      获 取 受 体 蛋 白    HSPA6（ PDB  ID:  7L066） 三 维 结
               对照组    A−实验组    A)/(正常细胞对照组        A−空白对照        构。准备并优化五氟利多分子结构。基于人源
               组  A)×100%。                                      Hsp70 变构抑制剂结合位点设定对接区域。使用
                2.3    平板克隆实验检测细胞集落形成能力                         AutoDock Vina 进行半柔性对接（小分子柔性，蛋白
                    将  A375、B16 细胞接种于      6 孔板。培养     3 ~4 d   刚性），搜索最优结合位置和构象。评分筛选结合
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