Page 77 - 《中国药科大学学报》2026年第1期

第 57 卷第 1 期 葛 姮，等：五氟利多靶向 HSPA6 抑制黑色素瘤生长的作用研究 71

亲和力最高的前 9 种模式。分析工具生成 2D（氢 37 ℃、5% CO 孵育 6 h 后更换完全培养基。转染
2
键、Pi-Alkyl 等作用力）和 3D 相互作用图，预测生 72 h 后，Western blot 检测蛋白表达；流式细胞术
物活性。 （Annexin V-FITC/PI 双染）检测凋亡；CCK-8 法检
2.9 表面等离子共振（SPR）结合实验 测细胞存活率。
利用胺偶联法固定 HSP76 蛋白至 CM5 芯片 2.12 C57BL/6J 小鼠荷瘤模型
表面 [ 经 NHS/EDC 活化后，注入 40 μg/mL 蛋白至 于 C57BL/6J 小鼠右下肢与腹部交界处，皮下
5
响应值 (response units,RU) 约为 11 000，乙醇胺封 接种 B16 细胞悬液（5×10 个细胞）。当肿瘤体积达
闭 ]，检测不同浓度五氟利多溶液（0.78～50 μmol/ 到约 100 mm 时，将荷瘤小鼠随机分为 6 组（n=5）：
3
L，含 0.5% DMSO 的 PBST）的结合特性：流速 30 模型组（Model）、五氟利多处理组（Penfluridol）、
μL/min，结合相 90 s，解离相 180 s，单循环再生 siRNA-NC 转染组（si-NC）、si-NC + Penfluridol 组、
（0.1% SDS）。采集的数据经稳态亲和模型拟合后 si-HSPA6 慢病毒转染组（si-HSPA6）以及 si-HSPA6
2
（提取 85~90 s 终点信号），仅采纳 Chi 值小于 10% + Penfluridol 组。si-NC 和 si-HSPA6 慢病毒分别与
芯片表面最大结合量（R max ）的结果进行平衡解离 相应的体内转染试剂混合后，均采用瘤内注射方式
常数计算。 进行局部给药，五氟利多药物溶液（剂量为 10 mg/
2.10 DARTS 实验 kg）通过灌胃的方式进行给药，给药频率与剂量依
采用非变性裂解缓冲液（TNC）裂解 A375 细 据预实验和参考文献确定 [12−13] 。在干预期间，每隔
胞，收集上清液中的总蛋白，调整浓度至 5 μg/μL。 1 天测量并记录一次肿瘤体积。实验第 14 天结束
分两组：实验组加入五氟利多（终浓度 20 μmol/L， 时，采用二氧化碳吸入麻醉后颈椎脱位法处死全部
DMSO 终浓度 ≤ 1%）；对照组加入等体积 DMSO， 小鼠，解剖剥离肿瘤组织，测量并记录瘤重。
室温孵育 1 h。分别加入梯度稀释蛋白酶 K（1∶1 000 2.13 统计与分析
比例），室温消化 30 min。加入含 β-巯基乙醇的 实验数据以 x± s表示。SPSS 软件统计分析，
SDS 上样缓冲液 95 ℃ 加热 5 min 终止反应。12% P<0.05 为差异显著。
SDS-PAGE 电泳分离蛋白，考马斯亮蓝染色观察差
3 结 果
异条带。差异条带胶内酶解后进行 LC-MS/MS 分
析，UniProt 数据库鉴定靶蛋白。 3.1 五氟利多可抑制黑色素瘤细胞的增殖
2.11 A375 细胞转染实验 五氟利多处理可导致 A375 和 B16 细胞存活
将 A375、B16 细胞（70%~90% 融合度）接种 率显著下降，呈浓度依赖性，并确定其 IC 分别为
0
5
于 6 孔板。配制转染复合物：siRNA 或质粒 DNA 3.134 和 3.069 μmol/L（图 1-A）。据此选定后续实
（终浓度 10~40 nmol/L）与 Lipofectamine 3000 按比 验中，五氟利多的给药浓度为 2、4 和 6 μmol/L。平
例混合，室温孵育 15 min。将复合物加入细胞孔， 板克隆形成实验进一步证实，经五氟利多处理后，
A B A375 125 A375

125 A375 cells (24 h) IC =3.134 μmol/L 75 *
50
B16 cells (24 h) IC =3.069 μmol/L Relative colony number of control/% 100
50
50
100 25 0 ** **
Cell survival/% 75 B16 0 μmol/L 2 μmol/L 4 μmol/L 6 μmol/L 125 0 B16 4 6
2
c(Penfluridol)/(μmol/L)
50
75
25 Relative colony number of control/% 100 **
50
0 25 **
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0 2 4 6
c(Penfluridol)/(μmol/L) 0 μmol/L 2 μmol/L 4 μmol/L 6 μmol/L c(Penfluridol)/(μmol/L)

Figure 1 Effect of penfluridol on the proliferation of melanoma A375 and B16cells( x ± s, n=3)
A: MTT detection of the effect of different concentrations of penfluridol on cell viability of A375 and B16 cells; B: Effect of penfluridol on A375 and
B16 cells colony formation capacity detected by plate cloning experiments
*P < 0.05, **P < 0.01 vs 0 µmol/L group