Page 83 - 《中国药科大学学报》2025年第5期

第 56 卷第 5 期 谭玥玥，等：基于网络药理学研究藏茴香入血成分抗白癜风的作用机制 615

于肝素钠抗凝管内，按文献 [9] 方法处理含药血浆 2.5.2 酪氨酸酶活性测定 采用 L-DOPA 氧化法
样品。 检测细胞内酪氨酸酶活性 。在 490 nm 处测定吸
[10]
2.3 质谱检测方法 收度，计算公式为酪氨酸酶相对活性=（样品 A 490 /蛋
2.3.1 色 谱 条 件 色 谱 柱 Waters BEH C (2.1 白浓度）/（空白 A 490 /蛋白浓度）×100%，每组设置
18
mm×150 mm,1.7 μm)；流动相为 0.1% 甲酸的水溶 3 个重复样本。
液 (A)-甲醇 (B) 进行梯度洗脱 (0~5 min，5%B；5~ 2.5.3 细胞黑色素含量的测定 采用 NaOH 裂解
10 min， 5%~13%B； 10~14 min， 13%~20%B； 14~25 法测定细胞内的黑色素水平 。在 405 nm 波长下
[11]
min， 20%~27%B； 25~31 min， 27%~32%B； 31~37 测定吸收度，计算公式为黑色素相对含量=（样品
min， 32%~39%B； 37~67 min， 39%~46%B； 67~70 /蛋白浓度）/（空白 /蛋白浓度）×100%，每组
A 405 A 405
min， 46%~52%B； 70~72 min， 52%~55%B； 72~80
设置 3 个重复样本。
min， 55%~95%B； 80~90 min， 95%B)； 流 速 0.2
2.5.4 蛋白印迹 将 B16F10 细胞以每孔 5×10 个
5
mL/min； 柱 温 30℃ ， 进 样 体 积 5 μL， 检 测 波 长
细胞接种于 6 孔板，分别用 1、10、50 μmol/L 刺槐
254 nm。
素在 37 ℃ 下孵育 48 h。RIPA 裂解后离心，10 359
2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源 (HESI)，正、负离
r/min，20 min，BCA 试剂盒测定总蛋白，10% SDS-
子扫描模式，鞘气流速 40 L/min，辅助气流速 10
PAGE 电泳转膜，5% 脱脂奶粉封闭 1 h，将膜孵育
L/min，喷雾电压 3 kV，毛细管温度 350 ℃，最大喷
在特异性抗体 4 ℃ 过夜，TBST 洗涤 3 次后与相应
雾电流 100 µA，辅助气体温度 350°C，质量扫描范
二抗室温孵育 1 h。使用 ECL Western 印迹检测试
围 m/z 100~1 500 采用 MSE 模式采集各时间点的棒
剂盒检测蛋白带信号，ChemiDoc MP 成像，Image
状图，扫描间隔 0.2 s，低能量扫描时传输碰撞能量 6
J 分析条带灰度。
eV，高能量扫描时传输碰撞能量 25~50 eV；选择 1.0
ng/L 亮氨酸脑啡肽进行质量实时校正，流速 10 3 结 果
μL/min，数据采集由软件 MassLynx 4.1 控制。
3.1 藏茴香化学成分鉴定
2.4 藏茴香治疗白癜风的网络药理学分析
通 过 UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-HRMS 方 法 ，
将鉴别的入血化合物依次输入 SwissADME
在“2.3”项色谱和质谱条件下对藏茴香提取物进样
平 台 进 行 筛 选 （ GI 得 分 为 HIGH， 类 药 性 >
3 个 “ yes” ） ， 随 后 结 合 Pubchem 分 析 ， 输 入 分析，得到样品正、负离子扫描模式的总离子流图，
SwissTargetPrediction 数据库预测成分作用靶点。 见（图 1）。确定了藏茴香果实中 88 个色谱峰，经
通过 OMIM 数据库、GeneCards 数据库、DisGeNET 过 CD（compound discoverer）软件辅助鉴定碎片离
数 据 库 、 TTD 数 据 库 检 索 白 癜 风 “ Vitiligo” 和 子比对，对比对照谱图，准确鉴定出 33 个化合物，
“Leucoderma”关键词，获取白癜风潜在疾病治疗靶 这些化合物中包含黄酮类 3 个，黄酮苷类 6 个，其
点。通过入血成分的作用靶点与白癜风治疗靶点 他糖苷 3 个，酚酸类 7 个，其他有机酸类 9 个，氨基
之间的交集绘制 Venny 图。应用 STRING 数据库 酸 3 个，萜类 1 个，酮类 1 个。通过文献比对推测
对输入基因的相互关系进行整理和预测，绘制 了其他 55 个化合物结构。
PPI 蛋白互作网络图。通过 Cytoscape 3.9.1 进行可 3.2 藏茴香入血成分及其代谢产物鉴定
视化处理。使用 DAVID 数据库对藏茴香治疗白癜 在“2.3”项谱和质谱条件下对藏茴香入血样品
风的潜在基因靶点进行 GO 富集分析和 KEGG 通 进行分析，经大鼠灌胃藏茴香提取物后的血浆样品
路分析，进一步筛选活性成分、靶点及通路，构建 和空白血浆对照样品比对（图 2），获得原型入血成
“关键有效成分—核心靶点—通路”网络。 分 11 个，26 个代谢产物，8 个其他化合物，共计
2.5 体外实验 45 个化合物（表 1）包括氨基酸类 2 个、芳香酸类
2.5.1 细胞活力与毒性 采用 CCK-8 法检测不同 2 个、酚酸类 10 个、黄酮及黄酮苷类 13 个、咖啡酰
浓度（0、1、10、20、30、40、50 μmol/L）刺槐素对 基奎宁酸类 2 个、萜类 4 个、脂肪酸及脂肪酸苷类
B16F10 细胞活力的影响。 8 个、其他化合物 4 个。