Page 94 - 《中国药科大学学报》2025年第4期

490 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(4): 488 − 497 第 56 卷

鼠 CD196-PE/cyanine7 抗体和抗小鼠 CD4-FITC 抗 Table 1 Primer sequence of qPCR in Citrobacter rodentium
体（美国 Biolegend 公司）；抗小鼠 CD25-BB700 抗 Gene Sequence (5’-3’)
体（美国 BD Biosciences 公司）。 16SrRNA F:GGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG

R:CATCGTTTACGGCGTGGACTACC
1.2 仪 器
NleA F:TGTGGTGAAACAACGGCTCT
流式细胞仪（美国 BD 公司）；PCR 仪（日本
R:TATGCCTGGAACGGAACTGG
TaKaRa 公司）；酶标仪、实时 PCR 扩增仪（美国 NleB F:GCTCCTGATGGTATCGCTGT
Thermo Fisher Scientific 公司）；细胞超净台（苏州安 R:AATGCCGCTTGAGTCCCTTT
泰空气技术有限公司）。 NleH F:AACCTGACTTCGCCTGATAATGCC

1.3 动物和菌株 R:TCTGTTGCCCACCTTTACTTGCG
C57BL/6J 小鼠 30 只，6~8 周龄，雌性，体重（15~ EspI F:CCAATGCTGTCCCCTCATGT
R:TACACGGGCAATGTCTTGCT
17 g），由徐州医科大学动物中心提供，合格证号：
EspZ F:TTACCACTGGCAGCCACAAT
SCXK（苏）2020-0011。鼠柠檬酸杆菌 Citrobacter
R:CCTAATACACCGGCTGCGAT
rodentium ATCC51459 （北京北纳创联生物技术研 Tir F:CAGGCTAAACGTCAGCAGGA
究院）。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。 R:TCGAGTATTTCCCCCGGTCT

2 方 法
有乙酸钠（67.5 mmol/L）、丙酸钠（40 mmol/L）和丁

2.1 C.r.活化、培养 酸钠（25.9 mmol/L）。动物实验中使用的短链脂肪
[7]
取 C.r.菌悬液，于 LB 固体培养基及麦康凯琼 酸浓度基于之前的研究 。在第 1 天，感染模型组、
脂培养基上进行平板划线活化培养，37 ℃ 培养箱 丙酸钠干预组、混合 SCFAs 干预组小鼠通过灌胃
8
内过夜培养。隔天挑取单个 C.r.菌落接种于无菌 C.r.（5×10 CFU/0.2 mL）诱导结肠炎模型 [14] 。第
LB 液体培养基，在 37 ℃ 恒温培养振荡器内 220 15 天解剖小鼠，测量结肠长度，将远端结肠浸入 4%
r/min，过夜培养。复苏、活化菌株成功后，再传代培 多聚甲醛溶液中固定，收集其余结肠组织至−80 ℃
养 1~2 代恢复活力后，可进行相关后续试验。 供后续检测，收集肠系膜淋巴结用于流式细胞术检
2.2 体外 C.r.生长与定植能力测定 测 CD4 Th 细胞分型。
+
用 LB 培养基接种单个菌落，培养条件为 37 ℃， 2.4 小鼠体重、排菌量监测
8
220 r/min 振荡过夜。将 C.r.（5×10 CFU）接种在 在造模期间，每隔 1 天监测小鼠的体重变化以
96 孔中，其中酸碱度不同的 LB 培养基含有不同浓 每只小鼠初始体重的百分比表示。同时收集感染
度的丙酸钠（8, 25 mmol/L）和混合 SCFAs（26.68, 组小鼠粪便，使用无菌 PBS 溶液将小鼠粪便调至质
83.375 mmol/L），每小时使用酶标仪在 600 nm 的波 量浓度 0.1 μg/μL，在选择性麦康凯培养基上涂板，
长下测量每个孔的数值。用 LB 培养基接种单个菌 于 37 ℃ 培养箱过夜培养后计数菌落。
落，振荡过夜后提取总 RNA，qPCR 检测细菌定植 2.5 结肠病理 HE 检测和 qPCR 检测
相关毒力效应因子的表达，所使用引物列于表 1。 将置于 4% 多聚甲醛中固定的远端结肠组织

2.3 小鼠分组及模型构建 包埋后切片，经苏木素-伊红（HE）染色后用显微镜
本研究经徐州医科大学实验动物伦理委员会 拍照观察。将冻存于−80 ℃ 的结肠组织加入 Trizol
批准（批准号：202208S015）。小鼠适应性喂养 5 d 溶液提取 RNA 并按照试剂盒方法逆转录成 cDNA
后，随机分为非感染组：空白对照组（Cont）、丙酸钠 后，根据 qPCR 试剂盒方法检测结肠炎症因子 IL-6、
组（Cont+Pro）、混合 SCFAs 组（Cont+SCFAs），感染 TNF-α 及抗菌肽 IL-17、IL-22、Reg3γ 水平，所使用
组：感染模型组（C.r.）、丙酸钠干预组（C.r.+Pro）、混 引物列于表 2。

合 SCFAs 干预组（C.r.+SCFAs）。各组小鼠饮用水 2.6 肠道通透性检测
不同，连续饮用 14 d。空白对照组和感染模型组小 在造模第 9 天，小鼠提前禁食 6 h，然后灌胃
鼠饮用无菌 PBS 溶液，丙酸钠组小鼠饮用水中含丙 FITC-葡聚糖 400 μg/20 g，90 min 后采集小鼠血液，
酸钠（150 mmol/L），混合 SCFAs 组小鼠饮用水中含 在 480 nm 波长处测量血液荧光值。