Page 85 - 《中国药科大学学报》2025年第4期

第 56 卷第 4 期 於珈墨，等：胸腺五肽促进 T 细胞浸润抑制小鼠肝细胞癌皮下瘤生长的作用研究 481

2.3 SRB 法测量肿瘤细胞吸收值 置于细胞培养箱（37 ℃，5％CO ）中培养 4 d。
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将“2.1”项下对应时间节点的 96 孔板，每孔加 2.7 ROS 检测
入 30% 三氯乙酸溶液 100 μL，4 ℃ 固定过夜后弃 TP5（1 000 ng/mL）处理 MDSCs 24 h 后，消化
上清液，纯水 200 μL 洗 5 次，37 ℃ 烘箱放置 2 h 细胞，离心。按照 1∶1 000 用无血清培养液稀释
后，每孔加入 0.4% SRB 染料 100 μL，室温染色 2 h， DCFH-DA，使终浓度为 10 μmol/L。细胞收集后悬
弃去 SRB，每孔用 1% 乙酸 200 μL 浸洗 10 ~ 15 次 浮于稀释好的 DCFH-DA 中，37 ºC 细胞培养箱内孵
至完全洗去未结合的 SRB 染料，37 ℃ 烘箱烘干；每 育 20 min。每隔 3~5 分钟颠倒混匀一下，使探针和
孔加入 Tris-Base 100 μL，水平摇床 75 r/min 振摇 细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞
10 min 后，于酶标仪 570 nm 处读取各孔的吸收值。 3 次，PBS 缓冲液 200 μL 重悬，流式细胞仪检测

2.4 肿瘤组织单细胞悬液制备 DCF 荧光强度，即为 ROS 信号。

准备无菌的 5 mL EP 管，将肿瘤组织于管中 2.8 Greiss 法检测 NO
剪成 5 ~ 10 mm 大小的组织块，用配制好的组织 不同浓度 TP5 处理 MDSCs 24 h 后，取细胞上
消 化 液 （ DMEM 培 养 基 、 0.5 mg/mL 胶 原 酶 D、 清液，1 500 r/min，离心 5 min，取上清液 50 μL 至
0.1 mg/mL 脱氧核糖核酸酶 I），以消化液 4 mL/个 96 孔板中，在各孔中依次加入室温 Griess Reagent
样品的体积重悬肿瘤组织，并转移至 gentle MACS I50 μL 和室温 Griess Reagent II 50 μL，540 nm 测定
C 管中，运行程序 37C_Multi_F，程序结束后，从 吸收度。根据标准品曲线计算出样品中一氧化氮
gentle MACS 组织处理器上取下 C 管，用 RPMI- 的浓度。

1640 培养基冲洗 C 管，用 70 μm 滤膜将上述研磨 2.9 ELISA 检测细胞上清液中 IL-6 水平
液过滤收集于 10 mL EP 管，离心（1 500 r/min，5 不同浓度 TP5 处理 MDSCs 24 h 后，取细胞上
min，4 ℃）弃上清液；每个样品以红细胞裂解缓冲 清液，1 500 r/min，离心 5 min，取上清液 100 μL 至
液 2 mL 重悬上述肿瘤细胞，室温静置 5 min 后，立 ELISA 板中。每孔加入生物素化抗体工作液 50
即加入 PBS 5 mL 终止裂解，离心（1 500 r/min，5 μL。混匀后，盖上封板膜，37 ℃ 温育 90 min。扣去
min，4 ℃）弃上清液，沉淀用 PBS 缓冲液 200 μL 重 孔内液体，每孔加入清洗工作液 300 μL，停留 1 min
悬，该溶液即为肿瘤组织单细胞悬液。 后弃去孔内液体，重复 4 次，滤纸上扣干。每孔加

2.5 流式细胞术检测肿瘤微环境中的免疫细胞 入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液 100 μL，
肿瘤组织单细胞悬液采用 Fc blocking 封闭 30 盖上封板膜，37 ℃ 温育 30 min。扣去孔内液体，每
min；封闭后加入 LIVE/DEAD Violet 染料冰上孵育 孔加入清洗工作液 300 μL，停留 1 min 后弃去孔内
20 min, 进行死活细胞标记；PBS 缓冲液润洗 1 次 液体，重复 4 次，滤纸上扣干。每孔加入辣根过氧
后，加入 CD45、CD3、CD4、CD8、CD11b、Ly6G 流 化物酶底物 100 μL，37 ℃ 避光孵育 10 min，每孔加
式抗体，混匀后置于 4 ℃，避光冰上孵育 30 min。 入 终 止 溶 液 100 μL 终 止 反 应 。 10 min 后 ， 450
PBS 清洗 2 次后，使用流式细胞仪检测各免疫细胞 nm 检测吸收度。使用 Curve Expert 1.4 软件绘制标
比例。 准品曲线，并计算样品中 IL-6 浓度。

2.6 MDSCs 分离及培养 2.10 活性 T 细胞检测
颈椎脱臼法处死小鼠。处死后的小鼠置于 将圆底 96 孔板加入含 5 μg/mL CD3 抗体的
75％的酒精中浸泡消毒 1～2 min，然后仰卧位固定 PBS 缓冲液 50 μL，4 ℃ 过夜。第 2 天用 PBS 缓冲
于泡沫平板上。在超净台中无菌操作取小鼠股骨 液洗去未结合的抗体。取小鼠脾脏细胞，流式分选
及胫骨，注射器吹出骨髓腔中细胞，过滤后将细胞 出 CD4 T 和 CD8 T 细胞，以 2 μg/mL 的 CD28 抗体
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悬液于 15 mL 管中，1 500 r/min，离心 5 min，弃上清 溶液重悬，96 孔板中每孔加入 2 × 10 个细胞，激活
液，混匀，加入红细胞裂解液 1 mL 孵育 1 min，再加 48 h 后 ， 洗 涤 细 胞 、 计 数 ， 继 续 用 含 TP5（ 1 000
入 PBS 缓冲液 5 mL 终止破红，1 500 r/min，离心 5 ng/mL）、Lys-Asp-Leu-Tyr（750 ng/mL）处理 72 h。
min，弃上清液，加入 RPMI 培养基 1 mL 重悬，即为 通过 Annexin V 评估 T 细胞活力。

小鼠骨髓细胞悬液。用含有 10 ng/mL GM-CSF 及 2.11 统计学分析
10 ng/mL IL-6 的 RPMI 培养基将骨髓细胞悬液稀 使用 GraphPad Prism 8.0 统计分析各项实验数
释至每毫升 3×10 个，接种到 24 孔平底培养板中， 据和作图, 每组数据以均值±标准误表示，两组独立
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