Page 84 - 《中国药科大学学报》2025年第4期
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               肽化合物胸腺生成素Ⅱ，并与胸腺生成素Ⅱ有着相                           动物饲养环境保持         12 h 交替昼夜节律，保持室内温
                                [5]
               同的全部生理功能 。相比胸腺生成素Ⅱ，其具有                           度  18~22 ℃，相对湿度      40%~60%。动物实验操作
               易合成、成本低及安全性高的优点。有研究表明，                           严格遵守国家科学技术委员会发布的《实验动物管
               胸腺五肽可以通过增强            NK  细胞活性改善肿瘤患              理条例》和中国药科大学新药安全评价研究中心转
               者细胞免疫功能，但其对肝癌的调控作用尚不清                            化医学实验室动物伦理委员会章程。动物合格证
               楚。本研究旨在探讨胸腺五肽对                HCC  的调控作用         编号为    20210407Abzz0600000535。动物伦理编号
               及其机制，为      TP5 的临床应用提供实验依据。                     B20210329-1。


                                                                1.4    仪 器
               1    材 料
                                                                     移液枪、细胞培养箱、多功能酶标仪、流式细

               1.1    试 剂                                       胞仪、实时定量        PCR  仪（美国    Thermo Scientific 公
                    TP5（海南中和药业股份有限公司）；DMEM                培     司）；细胞计数仪        [ 耐细隆生物仪器        (上海) 有限公
               养基（以色列       BI 公司）、FBS     血清（以色列       BI 公    司  ]；实时高通量荧光成像分析仪（上海美谷分子仪
               司）；青霉素-链霉素双抗（苏州新赛美生物科技有限                         器有限公司）。

               公司）；甲苯磺酸索拉非尼片（德国拜耳医药保健有
                                                                2    方 法
               限公司）；SRB（美国       Sigma 公司）；BSA（北京索莱宝
               科技有限公司）；LIVE/DEAD Violet（美国            Thermo    2.1    细胞给药方法
               Scientific 公 司 ） ； 白 细 胞 分 化 抗 原     3  （ 美 国         收集处于对数生长期的             Hepa1-6 细胞，1 500
               Biolegend，cluster of differentiation 3, CD3，克隆号：  r/min 离心  5 min，使用  DMEM  完全培养基（DMEM
               17A2）、白细胞分化抗原          4 （美国  Biolegend，cluster  培养基-血清，9∶1）重悬细胞，以每孔               3 000 个细胞
               of differentiation 4, CD4，克隆号：RM4-5)、白细胞分        均匀铺至     96 孔板中，放置于       37 ℃、5% CO 的恒温
                                                                                                      2
               化抗原    8 （cluster of differentiation 8, CD8，克隆号：  培养箱内培养。待细胞完全贴壁后，吸去旧培养
               53-6.7）、白细胞分化抗原          45（cluster of differenti-  基，加入新的培养基并给药。空白组仅将培养基
               ation 45, CD45，克隆号：30-F11）、白细胞分化抗原               加入到未铺细胞的          96 孔板中，对照组不加入任何
               11b （cluster of differentiation 11b, CD11b，克隆号：  药物，给药组分别将         10、100 和  1 000 ng/mL TP5 加
               M1/70） 、 淋 巴 细 胞 抗 原    6 复 合 体   （ lymphocyte   入  Hepa1-6 细胞中。给药前（0 h）及给药后             6、12、
               antigen 6 complex, Ly6G，克隆号：1A8）、Annexin         24、48 及  72 h 分别将   96 孔取出，用于      SRB  检测细
               V  流式抗体（美国        Biolegend 公司）；重组的小鼠            胞活性。

               GM-CSF、IL-6（美国     Peprotech 公司）；NO  检测试剂        2.2    肝癌模型建立
               盒（碧云天公司）；Lys-Asp-Leu-Tyr 委托金斯瑞生物                      Hepa1-6 模型：将    18 只在  SPF  条件下饲养管
               科技有限公司合成。                                        理的健康小鼠皮下接种             2 × 10 个/只   Hepa1-6 细
                                                                                             6

               1.2    细胞株                                       胞，10 d 后按照瘤体积随机分成            3 组，每组   6 只，分
                    小鼠肝癌细胞       Hepa1-6、人肝癌细胞        LM3 细     别为模型对照组（生理盐水）；TP5 低剂量组（10
               胞购买自中国科学院细胞库。                                    mg/kg）；TP5 高剂量组（20 mg/kg），每只小鼠腹腔注

               1.3    动 物                                       射，每天    1 次。游标卡尺测量肿瘤长径和短径，肿
                                                                                              2
                    雄性   C57BL/ 6N  小鼠，体重     18~22 g，6~8 周     瘤体积计算公式为         V=长径 × 短径 /2。每两天测瘤
               龄，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动                           1 次。实验终点时脱颈处死后解剖，分离皮下肿瘤
               物合格证编号为        20210407Abzz0600000535，许可证        组织并称重。
               号  SCXK（浙）2020-0002。使用前在笼中适应至少                        LM3 模型：15 只雌性      Balb/c Nude 小鼠皮下接
                                                                        7
               1 周，每笼   5~6 只小鼠。                                种  1 × 10 个/只  LM3 细胞，接种后第        8 天，按照瘤
                    雌性   Balb/c Nude 小鼠，体重    15~16 g，5~6 周     体积随机分为        3 组。对照组给予注射同体积的生
               龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，动                           理盐水，TP5 高剂量组（20 mg/kg），腹腔注射，每天
               物合格证编号为         202107086，许可证号      SCXK（苏）      1 次；阳性对照索拉非尼（30 mg/kg），灌胃注射，每
               2018-0008。所有实验用动物均饲养于中国药科大                       天  1 次。实验终点时脱颈处死后解剖，分离皮下肿
               学新药安全评价研究中心             SPF  动物房，自由饮食。           瘤组织并称重。
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