Page 75 - 《中国药科大学学报》2025年第4期
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第  56 卷第  4 期         郭光耀，等：PPARβ    激动剂   ZLY16 促进肌再生及改善      mdx 小鼠运动能力                  471

               1.2    仪 器                                       4 000 r/min 离心  10 min。吸取上清液按照试剂说明
                    CM3050S  冷 冻 切 片 机 （ 德 国 徕 卡 公 司 ） ；        书测定血清      TG、TC  含量。

               BX53 正置显微镜、FV3000 激光共聚焦显微镜（日                     2.4    苏木素-伊红（HE）染色
               本  Olympus 公司）；Varioskan LUX 多功能酶标仪、                  将冷冻包埋后的骨骼肌组织于冰冻切片机切
               4 111 恒温  CO 培养箱（美国         Thermo Scientific 公  片，切片厚度为        9 μm。切片室温干燥         5 min 后，置
                            2
               司）；5 200 Multi 凝胶成像仪（中国上海天能科技有                   于苏木素     3 min，流水冲洗。置于        0.2%  的盐酸乙醇
               限公司）；大小鼠肌抓力测定仪（YLS-13A）；SW-CJ-                   中分化至呈现粉红色，流水冲洗。置于                   Scott 碱液
               2FD 超净工作台（苏净安泰空气技术有限公司）。                         中反蓝    1 min，流水冲洗。置于伊红中            15~20 s，流

               1.3    细胞系                                       水冲洗。75%−95%−100%        乙醇梯度脱水后，二甲苯
                    成肌细胞系      C2C12 细胞购自上海中国科学院                透化，树脂胶封片保存。最后，在               BX53 显微镜下观
               典型培养物保藏委员会细胞库。                                   察、拍照。


               1.4    动 物                                       2.5    组织免疫荧光染色
                    SPF  级雄性   C57BL/10ScSnJGpt-Dmdem3Cd4/           切片室温干燥       5 min 后，用  4%  多聚甲醛溶液
               Gpt 小 鼠 （ 5~6 周 龄 ， 以 下 称   mdx 小 鼠 ） 和 雄 性      固定   15 min。然后用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗
               C57BL/10ScSnJGpt 小鼠（5~6 周龄，以下称野生型                3 次，每次    5 min。用   5%  山羊血清室温封闭         1 h。
               wild-type，WT）购自江苏集萃药康生物科技有限公                     弃去封闭液，加上         fibronectin、MHC  或  eMyHC  抗
               司，生产许可证号：SCXK（苏）2020-0004，实验动物                   体，4 ℃  孵育过夜。吸弃一抗，PBS            洗涤后，滴加荧
               质量合格证编号：202 008 899。所有动物饲养于中                     光二抗和      DAPI，室温避光孵育         1 h。吸弃二抗，
               国药科大学动物实验中心屏障系统中，正常饮食饮                           PBS  洗涤后，滴加抗荧光淬灭剂封片，在激光共聚
               水，昼夜交替。所有动物实验均由中国药科大学伦                           焦显微镜     FV3000 下观察并拍照。

               理委员会批准（批准号：2021-05-012）。                         2.6    细胞培养及处理

                                                                     C2C12 细胞培养于含       10%  胎牛血清、1%     丙酮
               2    方 法
                                                                酸 钠 的 杜 氏 培 养 基 （ Dulbecco's  modified  eagle

               2.1    动物分组与给药                                   medium，DMEM）生长培养基中。当细胞融合度为
                    将  18 只  mdx 小鼠随机分为      3 组，包括模型组          90%~100%  时，培养基更换到含           2%  马血清和     1%
               （model 组）、ZLY16 组和     simvastatin 组。ZLY16 组     丙酮酸钠的      DMEM   分化培养基中，持续分化             4 d。
               小鼠连续      6 周灌胃   30 mg/kg ZLY16 ，simvastatin    实验分为     6 组，分别为空白组，PA         组（或称模型组，
                                                [11]
               组小鼠连续       6 周灌胃   20 mg/kg 辛伐他汀 ，同时            给 予  100  μmol/L  PA） ， ZLY16 给 药 组 （ 给 予  100
                                                     [14]
               WT  小鼠及模型组小鼠连续              6 周灌胃溶剂对照            μmol/L PA，再分别加入       5、10 或  20 μmol/L ZLY16）
               0.5% CMC-Na。给药      6 周后处死小鼠，解剖取腓肠               和  simvastatin 组（给予  100 μmol/L PA  和  10 μmol/L
               肌（gastrocnemius muscle，GAS）、胫骨前肌（tibialis        辛伐他汀）。

               anterior muscle，TA）、膈肌（diaphragm，DIA）。一侧         2.7    细胞活力检测
               肌肉进行冷冻包埋，另一侧快速液氮冷冻并转移至                                将  C2C12 细胞以每毫升       5×10   个细胞的密度
                                                                                                4
               −80 ℃  冰箱备用。                                     接种于    96 孔板中，待细胞贴壁后，吸弃培养基，加

               2.2    抓力测试                                      入  100 μmol/L PA，用不同浓度（0、0.625、1.25、5、
                    在小鼠给药第       42 天时进行肌抓力测定。将小                10、20、40、50 μmol/L）的    ZLY16 处理   24 h。吸弃
               鼠前肢放置在肌抓力测定仪抓板上，使躯干保持水                           药液后，加入      10% CCK8 溶液，37 ℃     反应   0~4 h 后
               平，匀速并且均匀用力地拖动小鼠尾巴，当小鼠前                           在     450 nm  处检测吸收度。
               肢脱离抓板时，记录肌抓力测定仪的读数，共测                            2.8    细胞尼罗红染色
               3 次，取平均值，两次测量之间间隔              5 min。                 C2C12 细胞用    4%  多聚甲醛溶液固定         15 min，

               2.3    血生化指标检测                                   再用   PBS  洗  3 次，每次   5 min。加入尼罗红染液
                    小鼠摘眼球取血，室温静置沉降               2 h 后，4 ℃、     和  DAPI 室温孵育      2 h。吸弃染液，PBS        洗涤后，
   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80