Page 22 - 《渔业研究》2026年第3期

第 3 期 张澳晴等： 鲤疱疹病毒 3 型 RAA-CRISPR/Cas12a 检测方法的建立 315

2.4 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 反应条件的优化 行 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 反应，以无 RNA 酶
为 进 一 步 提 高 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 水为阴性对照，通过比较不同反应条件下最小模板
的扩增效率，分别采用不同浓度的标准质粒（1.24× 检出情况确定最佳反应温度和反应时间，结果如
10 ~1.24×10 拷贝/μL）作为模板，以不同反应温度 图 3 所示，最佳反应温度为 39 ℃，最佳反应时间
0
3
（37、39、42 ℃）和反应时间（10、20、30 min）进 为 30 min。

b) 1 2 3 4 NC
a) 1 2 3 4 NC
37 ℃ 10 min

39 ℃ 20 min

42 ℃ 30 min

图 3 不同温度和时间条件下 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 反应的荧光结果图
Fig. 3 Fluorescence results of CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a reaction under different temperature and time conditions
3
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注：a. 1~4 表示不同温度（37、39、42 ℃）条件下以 4 个不同拷贝数标准质粒（1.24×10 ~1.24×10 拷贝/μL）为模版的
CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 反应的荧光强度；b. 1~4 表示不同反应时间（10、20、30 min）条件下以 4 个不同拷贝数标准
质粒（1.24×10 ~1.24×10 拷贝/μL）为模版的 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 反应的荧光强度。
3
0
Notes:a. 1−4 indicate the fluorescence intensity of the RAA-CRISPR/Cas12a reaction using 4 standard plasmids with different
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copy numbers (1.24×10 −1.24×10 copies/μL) as templates under different temperature conditions (37, 39, 42 ℃); b. 1−4 indicate the
fluorescence results of the CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a reaction using 4 standard plasmids with different copy numbers
3
0
(1.24×10 −1.24×10 copies/μL) as templates under different reaction time conditions (10, 20, 30 min).

2.5 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 灵敏性评价 PCR 检测，评价本实验建立方法的检测灵敏性。
为 评 价 建 立 的 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 结果如图 4 所示，RAA-CRISPR/Cas12a 的检测限
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方法的检测灵敏性，以不同浓度的标准质粒（1.24× 为 1.24×10 拷贝/μL，与目前中华人民共和国出入
10 ~1.24×10 拷贝/μL）作为模板，以无 RNA 酶水 境检验检疫行业标准（SN/T 1674—2014）推荐的
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为 空 白 对 照 ， 同 时 进 行 RAA-CRISPR/Cas12a 和 PCR 方法相比，检测灵敏性提高了 10 倍。

b) CyHV-3 1.24×10 6 c)

a) 1 2 3 4 5 6 7 NC 1.24×10 5 4 bp M 1 2 3 4 5 6 7
1.24×10
蓝光灯 20 000 1.24×10 3 2 000
1 000
LED 荧光强度 Fluorescence 10 000 1.24×10 2 1 750
1.24×10
NC
紫外光 1.24×10 0 500
250
UV 0 0 10 20 30 100
时间/min Time
图 4 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 方法与 PCR 方法对灵敏性的检测结果
Fig. 4 Sensitivity detection results of CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a method and PCR method
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注：a. 1~7 表示在 470 nm 波长 LED 蓝光和 UV 光源下 1.24×10 ~1.24×10 拷贝/μL7 个不同拷贝数标准质粒为模版的 CyHV-3
RAA-CRISPR/Cas12a 反应的荧光强度；b. CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 荧光曲线；c. PCR 方法检测灵敏性实验结果；1~7 表
示 1.24×10 ~1.24×10 拷贝/μL 标准质粒；M. DNA 标记 2000。
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Notes: a. 1−7 indicate fluorescence intensities of the CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a assay using 7 standard plasmids with
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different copy numbers (1.24×10 −1.24×10 copies/μL) as templates, measured under 470 nm wavelength LED blue light and UV light
source; b. Fluorescence curves of the CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a assay; c. Results of the PCR-based sensitivity test; 1-7 indicate
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standard plasmids with copy numbers of 1.24×10 –1.24×10 copies/μL; M. DNA marker 2000.
2.6 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 特异性评价 同源性的 CyHV-1 和 CyHV-2、临床上感染鲤和锦
为 评 价 建 立 的 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 鲤常见病毒性病原 CEV 和 SVCV，以及与鲤（锦
方法的检测特异性，选择与 CyHV-3 具有较高遗传 鲤）混养鲤形目鱼类常见病毒 GCRV-Ⅱ和 GCRV-Ⅰ