Page 19 - 《渔业研究》2026年第3期

312 渔 业 研 究 第 48 卷

织（World Organisation for Animal Health，WOAH） 了检测的灵敏性和特异性。
[7]
将其作为必须申报的疫病 ，同时中国农业农村部 本研究依据 CyHV-3 特异性保守基因 SphI 设
将其列为二类动物疫病。CyHV-3 具有高度传染 计引物和 CRISPR RNA（crRNA） ，筛选出最佳组
性，受感染的鱼在感染的不同阶段表现出不同的临 合建立了鲤疱疹病毒 RAA-CRISPR/Cas12a 快速检
床症状，如在急性感染期患鱼皮肤表面可见灰白色 测方法，旨在为 KHVD 的现场诊断提供新方法，
斑点和水泡，鳃丝出血并常伴有部分组织坏死，皮 为有效防控锦鲤疱疹病毒病提供技术支持。
肤和鳃黏液分泌增多；感染晚期患鱼眼球凹陷，体
表出血，并大规模死亡 [8-9] 。当水温在 15~25 ℃ 时， 1 材料和方法
CyHV-3 增殖速度最快，患鱼可表现出典型的临床症 1.1 主要材料与试剂
状；而水温低于 10 ℃ 或高于 30 ℃ 时，CyHV-3 增 RAA 核酸扩增试剂（基础型） （S001ZC）购
殖速率大幅下降 [10] ，患鱼处于潜伏感染状态，当水 自杭州众测生物科技有限公司；CRISPR/Cas12a DNA
温适宜时，CyHV-3 由潜伏感染转化为急性感染， 检测试剂盒（D-F-CAS12-2S）购自深圳易致生物科
并呈现周期性传播 [11] 。由于 KHVD 的敏感宿主和 技有限公司；pMD™ 19-T Vector Cloning Kit、rTaq
临床症状与鲤浮肿病相似 [12] ，同时具有潜伏感染 聚合酶购自 TaKaRa (大连宝生物) 公司；琼脂糖凝
的特点，这进一步给该病的诊断和防控增加了难 胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）购自 omega BIO-
度 [13-14] 。CyHV-3 为双链 DNA 病毒，基因组长度为 TEK。核酸分析仪（Nanodrop ONE）购自 Thermo；
295 kb，含 156 个开放阅读框（Open reading frame， Deaou-308C 恒温荧光 PCR 仪购自广州迪澳生物科
ORF） 。其中，SphI 基因位于 ORF54，编码 DNA 聚 技有限公司；全自动核酸提取仪（VNP-32P）购自
合酶相关蛋白，是 CyHV-3 基因组中重要的保守基 南京诺唯赞医疗科技有限公司。CyHV-3、鲤疱疹病
因，也是用于 CyHV-3 核酸检测的关键靶基因 [15] 。 毒 1 型（Cyprinid herpesvirus 1，CyHV-1）毒株、鲤疱
目前还没有治疗 KHVD 的有效药物，在中国 疹病毒 2 型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）毒株、
用于预防 KHVD 疫苗制剂均处于研发阶段；国际 草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型（Grass carp reovirus，GCRV-Ⅰ）
上，2004 年以色列研制的 CyHV-3 传统减毒疫苗 毒株、草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型（Grass carp reovirus，
虽然在该国获批使用，但在中国尚未获批上市 [16-17] 。
GCRV-Ⅱ）毒株、鲤春病毒血症病毒（Spring virae-
在生产中，随贸易流通的苗种和被污染的养殖水源 mia of carp virus，SVCV）毒株、鲤浮肿病毒（Carp
都可能是 CyHV-3 的重要传播媒介 [18-20] ，因此建立早 edema virus，CEV）毒株均由本实验室分离保存。
期快速、精准、适用于养殖现场使用的检测方法对 1.2 方法
于切断 CyHV-3 传播具有重要意义 [18] 。目前，中华 1.2.1 样品处理与核酸提取
人民共和国出入境检验检疫行业标准（SN/T 1674— 本实验所用的临床样品和 CyHV-1、CyHV-2、
2014）和 WOAH 推荐使用的两种聚合酶链式反应 GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ、CEV、SVCV 病毒培养物
（Polymerase chain reaction，PCR）检测方法检测 均按照全自动核酸提取仪（VNP-32P）的使用说明
结果准确可靠，在控制 CyHV-3 传播过程中发挥了 书操作，采用磁珠法提取核酸，并使用紫外分光光
重要作用，但也存在灵敏性较低、检测时间长、操 度计对所提取的核酸的质量进行分析，所提取核酸
作繁琐等问题，并且对实验设备和操作人员有一定 在−20 ℃ 保存备用。
的要求，无法满足基层养殖病害检测和流通苗种的 1.2.2 重组质粒标准品的制备
实时监测 [19-20] 。重组酶介导链置换核酸扩增技术 以 NCBI 公布的 SphI（AY568950.1）基因序
（Recombinase-aid amplification，RAA） ，利用重组 列作为参考序列设计引物（表 1） ，以 CyHV-3 的
蛋白酶及单链结合蛋白等物质参与反应，简化了 细胞培养物作为阳性样品，提取总 DNA 作为模板，
PCR 反应温度循环过程 [17-19] ，为动物疫病现场快 PCR 扩增获取目的 DNA，并与 pMD19-T 载体连接
速诊断提供了新的手段 [20-22] 。CRISPR-Cas12a 具有 后在 DH5α 中克隆，用质粒小量极速提取试剂盒提
特异性识别与靶向切割活性，通过特异性识别并切 取质粒 DNA。采用核酸分析仪测定重组质粒 DNA
割扩增的靶向 DNA 片段，激活荧光报告分子读取 浓度，再按照公式：拷贝数（拷贝/μL）=（6.02×
检测结果 [22] 。通过结合 CRISPR-Cas12a 技术，不 10 拷贝/μL）×浓度（ng/μL）/分子质量（g/mol）
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仅实现了检测结果可视化读取，同时更进一步提高 计算标准质粒的浓度，将该重组质粒以 10 倍比进