Page 24 - 《渔业研究》2026年第3期

第 3 期 张澳晴等： 鲤疱疹病毒 3 型 RAA-CRISPR/Cas12a 检测方法的建立 317

3 讨论 性方面，本方法通过 RAA 引物与 crRNA 的双重靶
向，与 CyHV-1、CyHV-2、GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ、
鲤及锦鲤在中国水产养殖中占有重要地位，食
CEV、SVCV 等鲤（锦鲤）及混养鱼类常见病原均
用鲤含有大量优质蛋白质和不饱和脂肪酸，是中国
无交叉反应（图 5） ，特异性显著，与普通 PCR
大宗淡水经济养殖鱼类品种之一。 《2025 年中国
相当但更具操作优势。同时，临床样本检测结果显
渔业统计年鉴》统计结果显示，2024 年中国鲤鱼
示，本方法与中国水产行业标准推荐的 PCR 检测
养殖产量为 293.93×10 t，占全国淡水养殖总产量
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方法的检测结果完全一致（图 6） ，提示本方法具
的 8.32% [23] ；观赏锦鲤色彩艳丽，有水中活宝石之
有临床应用的能力。然而，本研究建立的 CyHV-3
称，是中国重要的出口创汇水产养殖品种。目前除
RAA-CRISPR/Cas12a 检测方法需在 2 个反应体系
西藏自治区外，中国各省市地区均有规模化的鲤 下进行，虽然与上述已有检测方法相比提高了检测
（锦鲤）养殖产业 [24-25] 。CyHV-3 是目前鲤及锦鲤
灵敏性和特异性，但也可能增加气溶胶污染的风
的主要病原之一，其发病死亡率高达 90% 以上， 险，导致检测结果出现假阳性。因此，如何利用
已严重威胁鲤和锦鲤的养殖安全 [26-27] 。CyHV-3 具
RAA 和 CRISPR/Cas12a 检测系统反应温度相近这
有高度传染性和潜伏感染的特点 [28-30] ，并且缺少有 一特点，通过简化操作流程，实现一步法完成检
效治疗药物和疫苗产品，这不仅给疫病防控带来了
测，是本研究未来探索的方向。
巨大难度，同时引发了药物滥用、环境污染、水产 综上所述，本研究成功建立了针对 CyHV-3 SphI
品质量安全等一系列问题 [31] 。因此，在发病早期
基因的 RAA-CRISPR/Cas12a 检测方法，具有特异
及时检出病原并切断传播途径，是目前防控 CyHV-3 性强、灵敏度高、反应快速、结果读取简便等优
的有效手段。
点，可以实现水产养殖现场快速检测，45 min 即可
从当前 CyHV-3 检测技术研究来看，中国行 完成对临床样品中 CyHV-3 病原检测，检出限可
业标准推荐的普通 PCR 方法（SN/T 1674—2014） 达 1.24×10 拷贝/μL。该方法满足实验室条件有限
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虽特异性稳定 [32] ，但其检测限仅能达到 1.24× 的养殖场快速病原筛查的需求，对 CyHV-3 的早期
10 拷贝/μL。彭军辉等 [33] 建立的鲤疱疹病毒 2 型 诊断、实时监控与防控具有重要意义。
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和 3 型三重 PCR 检测方法，该方法检测限为 2.85×
10 拷贝/μL，相比普通 PCR 方法灵敏度有所提高，
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参考文献（References） ：
但需依赖 PCR 仪完成复杂的的变温过程，耗时较 ［ 1 ］ Ababneh M, Hananeh W, Alzghoul M. Mass mortality
长，同时需通过琼脂糖凝胶电泳判读结果，难以 associated with koi herpesvirus in common carp in
满足现场快速检测的需求。Soliman 等 [34] 建立的 Iraq[J]. Heliyon, 2020, 6(8): e04827.
CyHV-3 的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal ［ 2 ］ Hedrick R P, Gilad O, Yun S, et al. A herpesvirus associ-
amplification，LAMP）方法，检测限为 30 拷贝/μL， ated with mass mortality of juvenile and adult koi, a
该方法虽无需变温设备，但其反应需在 60~65 ℃ strain of common carp[J]. Journal of Aquatic Animal
高温下进行，且因需设计 4~6 条引物，反应具有一 Health, 2000, 12(1): 44 − 57.
定的复杂性。相比之下，本研究建立的 CyHV-3 ［ 3 ］ Rahmati-Holasoo H, Zargar A, Ahmadivand S, et al.
RAA-CRISPR/Cas12a 方法在核心性能指标上优于 First detection of koi herpesvirus from koi, Cyprinus car-
上述技术：1）灵敏度方面，本方法最小检出限度达 pio L. experiencing mass mortalities in Iran: clinical, his-
1.24×10 拷贝/μL，较普通 PCR（1.24×10 拷贝/μL） topathological and molecular study[J]. Journal of Fish
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灵敏度提升一个数量级，更低的检测限使其能够检 Diseases, 2016, 39(10): 1153 − 1163.
出 CyHV-3 潜伏感染阶段的低载量病毒，为疫病早 ［ 4 ］ Gotesman M, Kattlun J, Bergmann S M, et al. CyHV-3:
期预警提供可能；2）反应效率与便捷性方面，本 the third cyprinid herpesvirus[J]. Diseases of Aquatic
方法全程在 39 ℃ 恒温条件下进行，45 min 即可完 Organisms, 2013, 105(2): 163 − 174.
成反应，且检测结果的荧光信号可通过蓝光照射肉 ［ 5 ］ 蒋昕彧，王啸宇，裴超，等. 鲤病毒性疾病发生与防
眼直接读取（图 3） ，无需依赖 PCR 仪等复杂设 控的研究进展 [J]. 南方农业学报，2021，52（2）：509 −
备，完全适配水产苗种产地检疫现场、基层养殖场 517.
日常监测等缺乏专业实验室条件的场景；3）特异 Jiang X Y, Wang X Y, Pei C, et al. Occurrence and pre-