Page 20 - 《渔业研究》2026年第3期

第 3 期 张澳晴等： 鲤疱疹病毒 3 型 RAA-CRISPR/Cas12a 检测方法的建立 313

行梯度稀释后，于−20 ℃ 保存备用。 在该序列前加上发卡结构即形成 crRNA 序列。在
1.2.3 CyHV-3 引物及 crRNA 设计 选定的 TTTN 序列前后位置分别选取保守区域, 根
以 NCBI 公布的 CyHV-3 基因组上特异性保守 据 RAA 引物设计要求 [21] ，利用 Primer Premier 5 软
基因序列 SphI 基因作为靶基因片段。在该区域范围 件设计 GCRV-Ⅱ型 RAA 扩增引物。寡核苷酸（引
检索 PAM（Protospacer adjacent motif）位点 [TTTN 物和 crRNAs）的工业合成由生工生物工程（上海）
（N=A，T，G）]，向后选取 20 nt 作为备选序列， 股份有限公司完成，序列信息见表 1。

表 1 引物与 crRNA 序列
Tab. 1 Primers and crRNA sequences
引物名称 引物及 crRNA 序列（5’–3’ ）
Primer name Primer and crRNA sequence（5’–3’ ）
CyHV-3-RAA-F1 TGCCCGCTCAGAGGGACAATCTCAGCAACACC
CyHV-3-RAA-R1 GTTACAATGGTCGCATCAATGTTGGGAGG
CyHV-3-RAA-F2 TGCCCGCTCAGAGGGACAATCTCAGCAACACC
CyHV-3-RAA-R2 AGAGGTTTGCGTTTTTATTAAGACACATG
CyHV-3-RAA-F3 ACGCCGCAACAGTCGCAGTCGTTCAAGAAGC
CyHV-3-RAA-R3 GTTACAATGGTCGCATCAATGTTGGGAGG
CyHV-3-RAA-F4 ACGCCGCAACAGTCGCAGTCGTTCAAGAAGC
CyHV-3-RAA-R4 CATCACAAAAAGGCACGGGGTTAAGAGGT
CyHV-3 crRNA1-1 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCCGUGCGCUGCGGGUCCUCG
CyHV-3 crRNA1-2 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCCCGUGCGCUGCGGGUCCU
CyHV-3 crRNA2-1 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUAAGACACAUGUUACAAUG
CyHV-3 crRNA2-2 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUAUUAAGACACAUGUUACAA

1.2.4 引物筛选 Cas12a 第一步扩增产物，37 ℃ 孵育 30 min。以 1.2.2
以制备的 CyHV-3 标准质粒为模板，使用 RAA 中构建的标准质粒为模板，分别对 4 组 crRNA
核酸扩增试剂盒，依据不同引物的扩增效率对引物 （表 1）进行筛选，通过扩增曲线的荧光值及起峰
进行筛选。将 25 μL A Buffer，13.5 μL Nuclease-free 时间，选择最优的 crRNA 引物组。
H O，RAA 上、下游引物各 2 μL（引物浓度均为 以不同稀释倍数的标准质粒作为模板，采用筛
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10 μmol/L）混合均匀后加入装有反应干粉的检测 选优化的引物和 crRNA 组合，分别采用 37、39
单元管中，然后加入 5 μL 待测 DNA 样本，向检测 和 42 ℃ 三个不同温度进行恒温反应 30 min，通过
单元管盖上加入 2.5 μL B Buffer，盖上管盖，上下 比较不同反应温度的最小模版量检出情况确定最佳
颠倒轻甩充分混匀 5~6 次，低速离心 10 s；将检测 反应温度；再在最佳反应温度下，分别进行 10、
单元管放入 39 ℃ 恒温扩增仪中孵育 30 min。反应 20 和 30 min 反应，根据比较不同反应时间下、不
结束后，加入 50 μL 酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1） 同浓度模板的检出情况，确定最佳反应时间。
抽提液进行纯化，充分混匀后 12 000 r/min 离心 1.2.6 灵敏性评价
5 min，取上清液进行电泳检测。 将 1.2.2 中制备的 7 个浓度梯度的阳性质粒标
1.2.5 CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a 检 测 体 系 准品作为模板（1.24×10 ~1.24×10 拷贝/μL） ，采
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建立和 crRNA 筛选 用本研究建立的 RAA-CRISPR/Cas12a 方法进行检
使 用 CRISPR/Cas12a DNA 检 测 试 剂 盒 建 立 测，以无 RNA 酶水为阴性对照，同时与中华人民
“CyHV-3 RAA-CRISPR/Cas12a”检测体系：第一 共和国出入境检验检疫行业标准（SN/T 1674—2014）
步扩增反应体系 20 μL，包括 10 μL R-mix（2×） ， 推荐的 PCR 检测方法进行比较，确定本研究建立
5 μL Core Mix（4×） ，RAA 上、下游引物各 0.5 μL 方法的检测灵敏度。
（引物浓度均为 20 µmol/L） ，2 μL DNA，2 μL 1.2.7 特异性评价
MgOAc 混匀；37 ℃ 孵育 30 min。第二步检测反应体 分 别 以 实 验 室 保 藏 的 CyHV-3、 CyHV-1、
系 20 μL，包括 2 μL Cleavage Buffer（10×） ，0.6 μL CyHV-2、GCRV-Ⅱ、GCRV-Ⅰ、SVCV 和 CEV 作
信号探针 Reporter（4 μmol/L） ，1 μL Cas12a protein 为模板，以无 RNA 酶水为阴性对照，采用本研究
（1 μmol/L） ，1 μL crRNA（Cas12a） （1 μmol/L） ， 建立的 RAA-CRISPR/Cas12a 进行检测，评价该方

10.4 μL Nuclease-free H O， 5 μL RAA-CRISPR/ 法的特异性。
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