Page 21 - 《渔业研究》2026年第3期

314 渔 业 研 究 第 48 卷

1.2.8 临床样本检测 以 CyHV-3 crRNA1-1、CyHV-3 crRNA1-2、CyHV-3
对 2023 年—2025 年本实验室采集的来自广东、 crRNA2-1 和 CyHV-3 crRNA2-2 进行 CRISPR/Cas12a
福建锦鲤养殖场 10 份临床样品，分别以本研究建 反应，根据 RAA-CRISPR/Cas12a 荧光曲线产生的
立的 RAA-CRISPR/Cas12a 方法和中国水产行业标 时间和荧光强度，筛选能够高效引导 Cas12a 蛋白、
准（SN/T 1674—2014）推荐的 PCR 法进行检测， 特异性识别靶标的 crRNA，结果如图 2 所示，CyHV-3
比较 2 种方法检测结果的符合率。本研究获得了中 crRNA2-1 引导的 Cas12a 蛋白的反式切割活性最
国水产科学研究院珠江水产研究所实验动物伦理委 高，可以在 2 min 左右产生扩增曲线，比其他 crRNA
员会批准，批准编号为 LAEC-PRFRI-2024-09-03。 更早，而且产生的荧光强度最高。因此，选择

2 结果 CyHV-3 crRNA2-1 进行应用于后续实验。

bp M 1 2 3 4
2.1 质粒标准品的鉴定
2 000
对纯化的标准质粒进行测序分析，结果表明
CyHV-3 SphI 基因正确插入到 pMD19-T 载体中， 1 000
750
其 总 DNA 浓 度 为 89 ng/μL， 质 粒 浓 度 为 1.24×
500
10 拷贝/μL，可作为后续实验的质粒标准品。
11
250
2.2 引物的鉴定筛选
100
本研究以 CyHV-3 的 SphI 基因作为靶基因共
设计了 4 对特异性引物。利用 RAA 基础型核酸扩
图 1 RAA 引物筛选
增试剂盒，以制备的 CyHV‑3 标准质粒为模板，进
Fig. 1 Screening of RAA primer combination
行 RAA 反应，通过电泳分析评价不同引物组的扩
注：M. DNA 标记 2000；1. 引物 CyHV-3-RAA-F1，CyHV-
增效率，并对引物进行筛选。结果如图 1 所示，4
3-RAA-R1 扩增产物；2. 引物 CyHV-3-RAA-F2，CyHV-3-RAA-
对引物均能够扩增出特异性的目的条带，其中引物 R2 扩增产物；3. 引物 CyHV-3-RAA-F3，CyHV-3-RAA-R3 扩
组 CyHV-3-RAA-F2，CyHV-3-RAA-R2 的扩增产物 增产物；4. 引物 CyHV-3-RAA-F4，CyHV-3-RAA-R4 扩增产物。
条带最亮，产物最多。因此，选用 CyHV-3-RAA- Notes: M. DNA marker 2000; 1. Amplification product of
primer CyHV-3-RAA-F1, CyHV-3-RAA-R1; 2. Amplification
F2，CyHV-3-RAA-R2 作为 RAA 反应的引物，用
product of primer CyHV-3-RAA-F2, CyHV-3-RAA-R2; 3. Ampli-
于后续检测方法的建立。 fication product of primer CyHV-3-RAA-F3, CyHV-3-RAA-R3;
2.3 crRNA 的鉴定筛选 4. Amplification product of primer CyHV-3-RAA-F4, CyHV-3-
根据最佳引物组设计不同的 crRNA 序列，并分别 RAA-R4.

a) b)
1 2 3 4 NC
CyHV-3 crRNA1-1
10 000
CyHV-3 crRNA1-2
荧光强度 Fluorescence 5 000 NC
蓝光灯 CyHV-3 crRNA2-1
LED CyHV-3 crRNA2-2
紫外光
UV
0
0 10 20 30
时间/min Time
图 2 crRNA 筛选结果
Fig. 2 Results of crRNA screening
注：a. 1~4 表示 CyHV-3 crRNA1-1、CyHV-3 crRNA1-2、CyHV-3 crRNA2-1 和 CyHV-3 crRNA2-2 分别在 470 nm 波长蓝
光灯和紫外光源下的荧光强度；b. CyHV-3 crRNA1-1、CyHV-3 crRNA1-2、CyHV-3 crRNA2-1 和 CyHV-3 crRNA2-2 荧光曲
线。NC. 阴性对照，无 RNA 酶水，图 3~图 6 同此。
Notes: a. 1-4 indicate fluorescence intensities of CyHV-3 crRNA1-1, CyHV-3 crRNA1-2, CyHV-3 crRNA2-1, and CyHV-3 crRNA2-2
under 470 nm wavelength blue light and ultraviolet light source, respectively; b. Fluorescence curves of CyHV-3 crRNA1-1, CyHV-3
crRNA1-2, CyHV-3 crRNA2-1, and CyHV-3 crRNA2-2. NC. Negative control, RNase-free water, it’s the same as figure 3−figure 6.