Page 80 - 《渔业研究》2025年第6期

第 6 期 刘子竞等： 基于适配体的纳米金比色法快速检测河豚毒素 771

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使其无法正常开放，进而影响细胞内外的 Na 浓度 条件，进行加标回收实验以证实其可行性，以期构
梯度，破坏细胞的正常电生理活动，迅速导致神经 建基于无标记 Apt 的 AuNPs 比色法用于 TTX 含量
麻痹和肌肉无力，最终可能引起呼吸衰竭和循环衰 的检测，为河鲀产业的发展提供技术支持
竭等严重后果 [9-15] 。
1 材料与方法
TTX 作为一种重要的生物毒素，在食品安全、
临床诊断和法医学鉴定中具有重要意义。其检测技 1.1 仪器与试剂
术的发展对于有效防范中毒事件和保障公共健康至 C-MAG HS 加热磁力搅拌器（德国 IKA 公司） ；
关重要 [16-17] 。目前 TTX 的检测方法主要有小鼠生 Centrifuge 5810R 高速冷冻离心机（德国艾本德股
物法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、液相色 份公司） ；KQ-600DB 超声波清洗器（昆山市超声
谱−质谱联用法。小鼠生物法虽操作简单，不需要 仪器有限公司） ；GL-88B 漩涡混合器（海门市其
特殊设备，但存在重复性差、受小鼠个体差异影响 林贝尔仪器制造有限公司） ；AR2130 电子分析天
大等缺点；酶联免疫吸附法虽灵敏度较高，适用于 平（上海奥豪斯国际贸易有限公司） ；Milli-Q 超
现场快速检测，但抗体的制备成本较高且不易保 纯水仪（法国 MILLIPORE 公司） ；HT7800 透射
存；高效液相色谱法和液相色谱−质谱联用法虽具 电子显微镜（日本 HITACHI 公司） ；M200 Pro 多
有高灵敏度和良好的重复性，但需要复杂的样品前 功能酶标仪（瑞士 TECAN Infinite 公司） ；ZQZY-
处理和昂贵的仪器设备 [18-21] 。针对以上方法的缺 78CE 电热恒温培养箱（上海知楚仪器有限公司） ；
点，未来的研究应进一步优化检测技术，降低成 CHB-T2-B+D 恒温金属浴（杭州博日科技有限公
本，提高检测的便捷性和可靠性。 司） ；DHG-9141A 电热恒温鼓风干燥箱（上海圣
适配体（Aptamer，Apt）是一类通过体外筛选 欣科学仪器有限公司） ；JXFSTPRP-24 全自动样
技术获得的、能够与特定靶标分子高亲和力结合的 品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司） 。
单链 DNA 或 RNA 序列 [22] 。其长度一般在 20 至 河豚毒素、石房蛤毒素、大田软海绵酸标准品
100 个核苷酸之间，解离平衡常数通常处于 10 −8 （美国 CATO 公司，1 mg，纯度≥98%） ；氯金酸
至 10 mol/L 的范围，表明其与靶标结合的高特异 （上海阿拉丁生化科技股份有限公司） ；柠檬酸三
−6
性和亲和力 [23] 。Apt 通过形成诸如发夹、茎环、凸 钠、氯化钠、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、盐酸、硝
起、假结和 G-四聚体等特定的二级和三级结构， 酸（国药集团北京化学试剂有限公司） ；TE 缓冲
与靶标分子的结构实现构象互补 [24-25] 。这种互补性 液（10 mmol/L Tris-HCL，0.1 mmol/L EDTA，pH
使得 Apt 能够通过氢键、静电相互作用、范德华力 8.0） 、TTX-D2-X-R（上海生工生物工程股份有限
和疏水作用等多种非共价相互作用力，与靶标产生 公司） ；磷钨酸（武汉赛维尔生物科技有限公
高特异性的结合 [26] 。与传统的抗体相比，Apt 具有 司） ；无毒鱼肉（鲈鱼，购于厦门市夏商生鲜超市） 。
生产成本低、化学合成快、批次间一致性好等优 本实验使用的 Apt 为 TTX-D2-X-R，由颜志超
点 [27] 。此外，Apt 能够区分结构相似的生物分子， 等 [27] 对 Gu 等 [35] 的 TTX-27 优化所得，序列为：5’-
使其在复杂生物体系中具有更高的选择性 [28] 。 ATAGGAGTCACGACGACCAGCTCCATTTATTCT
Apt 的稳定性和可修饰性也为其在生物医学领域的 AAATTr(C)TATAGACCGAAAGCGGTCTACCTCTT
应用提供了更多的可能性 [29] 。基于 Apt 和金纳米 GA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
颗粒（Gold nanoparticles，AuNPs）的比色检测技 1.2 实验方法
术，通过比较或测量着色物质溶液吸光度来定量分 1.2.1 AuNPs 溶液的制备
析目标成分含量，具备低成本、操作简便、检测结 首先将用于制备 AuNPs 溶液的玻璃器皿清洗干
果可视化等突出优势，并且该检测方法的灵敏度和 净，烘干，王水（3HCl∶1HNO ）浸泡 12 h，去离
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选择性已获验证，在无需复杂仪器的情况下，展现 子水冲洗干净，再烘干。接着，采用柠檬酸三钠还原
出快速现场诊断的潜在能力 [30-34] 。目前，用于检 法制备 AuNPs 溶液。向烧杯中加入 285 mL 去离子
测 TTX 的基于无标记 Apt 的纳米金比色法鲜有报 水和 3 mL 质量分数为 1％的氯金酸溶液，将烧杯置
道。因此，本研究以 AuNPs 作为指示剂，利用其 于加热磁力搅拌器上，持续搅拌并加热至溶液沸
在高盐环境下聚集导致颜色变化的特性，通过优 腾 [36] ；保持高速搅拌的状态下，一次性加入 12 mL
化 AuNPs 体积分数、NaCl 浓度、Apt 浓度等实验 质量分数为 1％的柠檬酸三钠溶液，持续加热搅