Page 76 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 孔维光等： Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒 VP4 兔源单克隆抗体的制备和鉴定 617

VP4 是 GCRV-Ⅱ的主要外衣壳蛋白，具有较 Bureau of Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural
强的免疫原性，并且在 GCRV-Ⅱ不同株型之间具 Affairs of the People’s Republic of China, National Fish-
有较高的保守性 [18-19] 。VP4 重组蛋白纯化质量直接 eries Technology Extension Station, China Society of
影响抗体的效能，本研究构建了 GCRV-YX246 的 Fisheries. 2025 China fishery statistical year book[M].

VP4 真核重组载体并转染至 HEK293 细胞进行表达， Beijing: China Agriculture Press, 2025.
纯化后获得了高纯度的目的重组蛋白。与其他研究 ［ 3 ］ Dong Z D, Zhang J, Ji X S, et al. Molecular cloning,
中使用原核表达系统生产的包涵体重组蛋白 [20-22] characterization and expression of cathepsin D from
相比，本实验通过真核表达系统获得的重组蛋白更 grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J]. Fish & Shell-
完整地保留了病毒结构蛋白的天然构象特征。单 fish Immunology, 2012, 33(5): 1207 − 1214.
个 B 细胞筛选技术可以高效快速地从单个 B 细胞 ［ 4 ］ Subramanian K, Hetrick F M, Samal S K. Identification
中得到抗体，是继杂交瘤和噬菌体展示之后抗体生 of a new genogroup of aquareovirus by RNA-RNA hybri-
产技术的突破 [23] 。由于每个 B 细胞只产生一种特 dization[J]. Journal of General Virology, 1997, 78(Pt 6):
异性抗体，该抗体仅包含一个功能性重链可变区 1385 − 1388.
DNA 序列和一个轻链可变区 DNA 序列，因而本研 ［ 5 ］ Wang Q, Zeng W W, Liu C, et al. Complete genome se-
究将重组 VP4 蛋白免疫白兔后，从脾脏中分离针 quence of a reovirus isolated from grass carp, indicating
对 VP4 的记忆性 B 细胞，利用单细胞 PCR 扩增， different genotypes of GCRV in China[J]. Journal of
Virology, 2012, 86(22): 12466.
从分泌 mAb 的 B 细胞中扩增出特异性 IgG 重链、
［ 6 ］ 李贤，曾伟伟，王庆，等. 草鱼呼肠病毒研究进展 [J].
轻链可变区和恒定区的基因序列，然后利用真核表
动物医学进展，2016，37（7） ：94 − 101.
达系统获得具有生物活性的成熟抗体。单个 B 细
Li X, Zeng W W, Wang Q, et al. Progress on grass carp
胞筛选技术作为新一代抗体开发平台，已在小鼠、
reovirus[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2016,
兔子、人等多种物种中成功获得高亲和力单抗。与
37(7): 94 − 101.
传统杂交瘤技术相比，单个 B 细胞技术避免了细
［ 7 ］ Chen J M, Li Y Y, Wang Y Y, et al. Establishment of a
胞融合效率低、抗体基因丢失等问题 [23] 。本研
rare minnow (Gobiocypris rarus) model for evaluation of
究从免疫白兔脾脏中分离 VP4 特异性 B 细胞并
experimental vaccines against a disease induced by grass
克隆抗体基因，其优势在于筛选周期短，并且获得
carp reovirus genotype Ⅱ[J]. Fish & Shellfish Immuno-
序列的单克隆抗体可以短时间内表达、保存稳定，
logy, 2021, 117: 53 − 61.
有利于大规模生产。此外，本研究对进一步筛选获
［ 8 ］ Feng Y, Shi C B, Ouyang P, et al. The national surveil-
得的抗体进行研究，发现该抗体具有良好的反应
lance study of grass carp reovirus in China reveals the
性，在 Western blot、IF 等实验中均能特异性地检
spatial-temporal characteristics and potential risks[J].
测 GCRV-Ⅱ病毒。
Aquaculture, 2022, 547: 737449.
综上，本研究使用 GCRV-YX246 VP4 蛋白为 ［ 9 ］ 王方华，李安兴. 草鱼病毒性出血病研究进展 [J]. 南
免疫原，制备了效价达 1∶128 000 的重组兔单克 方水产，2006，2（3） ：66 − 71.
隆抗体 1D5、1F9 和 1H1，该重组单克隆抗体在 Wang F H, Li A X. Advances in research of hemorrhage
IF 和 Western blot 检测中具有良好的特异性和反应 of grass carp[J]. South China Fisheries Science, 2006,
性，可以进一步为 GCRV-Ⅱ相关研究及诊断制剂 2(3): 66 − 71.
研发提供有效抗体和技术支撑。 ［10］ Gao Y, Pei C, Sun X Y, et al. Novel subunit vaccine

based on grass carp reovirus VP35 protein provides pro-
tective immunity against grass carp hemorrhagic disease
参考文献（References） ：
［ 1 ］ Cao L, Naylor R, Henriksson P, et al. China’s aquacul- [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2018, 75: 91 − 98.
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347(6218): 133 − 135. protein encoded by grass carp reovirus genotype Ⅱ[J].
［ 2 ］ 中华人民共和国农业农村部渔业渔政管理局，全国水 iScience, 2024, 27(8): 110502.
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年鉴 [M]. 北京：中国农业出版社，2025. HZ08 株 VP4 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 [J]. 水产