Page 71 - 《渔业研究》2025年第5期

612 渔 业 研 究 第 47 卷

VP4 蛋白
VP4 protein

免疫白兔 白兔血清 ELISA、IF 检测 脾脏单个 B 细胞分离培养 单个 B 细胞培养上清液筛选
Immunization of ELISA and IF testing of Isolation and culture of Screening of single B cell
rabbits rabbit serum splenic single B cell culture supernatants

VH D JH

Vκ Jκ

纯化抗体功能验证 重组抗体表达及纯化 抗体基因扩增及载体构建
Functional validation of Recombinant antibody Antibody gene amplification
purified antibodies expression and purification and vector construction
图 1 动物免疫及抗体制备模式图
Fig. 1 Schematic diagram of animal immunization and antibody preparation

注：VH、D 和 JH 分别表示重链可变区基因片段、多样性基因片段和重链连接区基因片段；Vк和 Jк表示 kappa 轻链可变
区和连接区基因片段。
Notet: VH, D and JH represent the variable (V), diversity (D), and joining (J) gene segments in the immunoglobulin heavy-chain
locus, respectively; Vк and Jк represent the variable (V) and joining (J) gene segments in the immunoglobulin kappa light-chain locus,
respectively.
1.8 IF 分析 基因序列，如图 2a 所示，利用同源重组的方式，
为验证 ELISA 初筛阳性单克隆抗体的特异 将 S6 基因序列与 pTT5 载体连接，成功构建真核
性，利用 IF 实验对健康草鱼和 GCRV-YX246 感染 表达载体。随后，通过 HEK293F 细胞表达系统进
草鱼组织切片进行检测。其中，感染组草鱼通过腹 行蛋白表达，利用 Protein A 亲和层析纯化后获得
腔注射 200 µL GCRV-YX246 病毒液攻毒，对照组 纯化的 VP4 蛋白。经 SDS-PAGE 分析（图 2b）显
草鱼则注射相同剂量的 PBS。在攻毒后的第 7 d， 示，在相对分子质量约 80 kDa 处呈现单一清晰条
采集健康草鱼和感染草鱼的头肾组织样本制备石蜡
带，表明所纯化 VP4 蛋白具有较高的纯度。
切片。首先对石蜡切片进行脱蜡和抗原修复后，
2.2 免疫白兔的血清效价
经 PBS（pH=7.4）洗涤 2 次（5 min/次） ，使用免
为评估两只白兔免疫后的血清抗体水平，通
疫组化笔圈定组织区域，经 0.3% Triton X-100 溶
过 ELISA 和 IF 实验进行检测免疫 5 次后白兔的血
液（PBS 配制）室温透化 15 min；PBS 洗涤后，加
清，其中 ELISA 检测结果显示两只免疫白兔的 VP4
入 5% 牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）
特异性抗体效价均可达到 1∶128 000（图 3a） ；
封闭液封闭 30 min，随后加入抗 GCRV VP4 重组兔
进一步通过 IF 分析血清的反应性，图 3b 的结果显
单克隆抗体（1∶100 稀释） ，于 4 ℃ 湿盒内孵育
示，白兔 A 血清在头肾组织中呈现的病毒特异性
过夜，阴性对照采用健康草鱼头肾组织切片。次日
经 PBS 洗涤 4 次（5 min/次） ，加入 Cy3 标记的山羊 荧光信号显著强于白兔 B。因此，选用白兔 A 进
抗兔 IgG 二抗（1∶10 000 稀释）避光孵育 40 min， 行后续脾脏单个 B 细胞分离和单克隆抗体制备。
PBS 洗 涤 后 ， 4’, 6-联 脒 -2-苯 基 吲 哚 二 盐 酸 盐 2.3 单个 B 细胞的特异性
核染 8 min，再洗涤 2 次，使用抗淬灭封片剂封 通过 ELISA 对 A 兔来源单个 B 细胞培养上清
片，在荧光显微镜下观察。 液进行检测，由表 2 可知，1D5、1F9 和 1H1 三株
单克隆抗体的 OD 值显著地高于阴性对照组。进一
2 结果与分析
步地采用组织 IF 分析 1D5、1F9 和 1H1 三株单个
2.1 GCRV-YX246 VP4 抗原表达纯化 B 细胞培养上清液的特异性，结果显示三株单克隆
采用 PCR 技术扩增 GCRV-YX246 毒株的 S6 抗体在 GCRV-Ⅱ感染草鱼头肾组织中均呈现强烈