Page 68 - 《渔业研究》2025年第5期

渔业研究 2025，47（5） ：609 − 619 http://www.hyyysci.com
Journal of Fisheries Research DOI:10.14012/j.jfr.2025070

孔维光，袁新婕，丁广义，等. Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒 VP4 兔源单克隆抗体的制备和鉴定[J]. 渔业研究，2025，47（5） ：609 − 619.
Kong W G， Yuan X J， Ding G Y， et al. Preparation and identification of rabbit monoclonal antibodies against VP4 of grass carp reovirus
genotype Ⅱ (GCRV-Ⅱ)[J]. Journal of Fisheries Research，2025，47（5） ：609 − 619.

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒 VP4 兔源单克隆

抗体的制备和鉴定

孔维光，袁新婕，丁广义，张环宇，徐 镇 *

（中国科学院水生生物研究所，水产品种创制与高效养殖全国重点实验室，湖北 武汉 430072）

摘要：【目的】Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV-Ⅱ）严重危害中国草鱼（Ctenoparyngodon idel-
lus）养殖业的健康发展。本研究基于单个 B 细胞抗体制备技术平台，结合哺乳动物表达系
统，旨在制备靶向 GCRV-Ⅱ VP4 蛋白的基因工程抗体。【方法】通过构建 GCRV-Ⅱ VP4 基
因表达载体，在真核表达系统中制备重组 VP4 蛋白；将纯化后的重组蛋白作为免疫原多次
免疫新西兰白兔，分离出脾脏单个抗原特异性记忆 B 细胞；随后通过聚合酶链式反应
（PCR）扩增抗体可变区、恒定区基因片段，构建重组表达载体并转染 HEK293F 细胞进行
单克隆抗体表达。最终通过酶联免疫吸附试验（ELISA） 、蛋白质免疫印迹（Western blot）
和免疫荧光分析（IF）评估抗体的抗原结合特性。【结果】通过对分离培养的单个 B 细胞上
清液进行筛选，利用 ELISA 筛选出对 VP4 蛋白具有较好结合能力的三种 B 细胞克隆
（1D5、1F9、1H1） ，并结合 IF 实验验证了其能结合病毒感染组织中的 VP4 抗原。进一步
通过抗体重组表达获得了三株抗 VP4 重组单克隆抗体（1D5、1F9、1H1） ，其 ELISA 效价
均达 1∶128 000。Western blot 分析结果显示，1D5、1F9 和 1H1 单克隆抗体能特异性识别 GCRV-
YX246 感染的脑细胞中 65.4 kDa 的蛋白质条带，该分子量大小与病毒 VP4 蛋白理论分子量
一致。IF 实验结果也进一步证实 1D5、1F9 和 1H1 可特异性识别 GCRV-YX246 毒株感染的
草鱼头肾组织切片中的病毒抗原。【结论】本研究成功制备并筛选出抗 GCRV-Ⅱ VP4 重组
单克隆抗体，为 GCRV-Ⅱ病毒快速诊断试剂盒的研发和 VP4 蛋白功能研究奠定基础。

关键词：Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒；VP4 蛋白；单个 B 细胞技术；单克隆抗体制备
中图分类号：S941 文献标识码：A 文章编号：2096 − 9848 （2025） 05 − 0609 − 11

中国是全球最大的鱼类生产国、消费国、加工 暴发呈显著上升趋势；草鱼出血病已成为威胁主养
国和出口国，近年来随着水产养殖集约化发展，养 区（华东、华南及华中七省）产业安全的首要疫
殖病害问题频发 。草鱼（Ctenoparyngodon idellus） 病，对草鱼养殖业造成巨大的经济损失。病原学研
[1]
作为中国较大宗的淡水养殖物种之一，其产量约占 究证实，草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）
[2]
淡水鱼总产量的 21.68% ，养殖区域主要分布于 是草鱼出血病的主要病原，作为水生呼肠弧病毒属
华东地区的江苏和安徽，华南地区的广东和广西， 成员，具有典型的双链核糖核酸（Ribonucleic acid，
[4]
[3]
以及华中地区的湖北、湖南和江西等省份 。近年 RNA）病毒特征 。基因组系统发育分析将 GCRV
[5]
来的流行病学调查数据显示，中国草鱼主养区疫病 划分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种基因型 。其中，GCRV-Ⅱ

收稿日期：2025-07-08 修回日期：2025-07-24
基金项目：国家自然科学基金 （32225050、U24A20461、32303053）
第一作者：孔维光，男，副研究员，博士，研究方向为鱼类免疫与病害防控。E-mail: kongweiguang@ihb.ac.cn
通信作者：徐 镇，男，研究员，研究方向为鱼类免疫与病害防控。E-mail: zhenxu@ihb.ac.cn
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