Page 70 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 孔维光等： Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒 VP4 兔源单克隆抗体的制备和鉴定 611

清用于后续酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked 感染 GCRV-YX246 毒株 7 d 的草鱼头肾组织为检
immunosorbent assay，ELISA）检测。在进行免疫 测样本，未稀释血清作为 IF 实验的一抗，兔源
荧光分析（Immunofluorescence assay，IF）时，以 IgG 作为同型对照（Isotype control，ISO） 。

表 1 PCR 引物序列
Tab. 1 Primers used in the PCR
名称 Name 序列（5’—3’ ）Sequences (5’—3’) 用途 Usage
S6-F GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGCACCTGTGCCTGTGTCCGCTCTGAGAACCCCACCTGT
质粒构建
S6-R TTATTAGCCAGAGGTCGAGGTCGGGTCAGGAAGGGGGGGGCCAGTATCTTGTCAGCTTGT
H-F GGTACCGAGCTCGGATCCATGGAGACTG
H-R GCTGGATATCTGCAGAATTCTCATTTACCC
抗体基因
L-F GGTACCGAGCTCGGATCCATGGACACGA
L-R CACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTCAGCAGTCA

1.5 ELISA 检测 LCH 载体：反应体系含 BamH Ⅰ或 EcoR Ⅰ限制性
实验采用 2 µg/mL 重组 VP4 蛋白 [0.05 mol/L 内切酶各 2 µL（10 U/µL） 、载体 1 µg、10×酶切
碳酸盐缓冲液（pH=9.6）稀释 ] 以 100 µL/孔包被 缓冲液 5 µL，37 ℃ 反应 60 min。经凝胶回收纯化
ELISA 板，4 ℃ 孵育过夜。次日弃去包被液，含 后，分别与 VH 和 VL 基因片段进行重组连接：连
0.05% 吐温−20 的 PBS（PBS Tween-20，PBST）溶 接体系含重组酶 10 μL、线性化载体 4 μL、PCR 产
液洗涤 3 次（3 min/次） ，随后加入 150 µL 5% 脱 物 6 μL，52 ℃ 反应 40 min。构建成功的 VH 和
脂乳 PBST 封闭液，于 37 ℃ 封闭 1 h。封闭后再次 VL 表达载体按 1∶1 比例共转染至 HEK293F 细
洗涤 3 次，从 1∶2 000 开始对血清样品或重组抗 胞。转染后置于 37 ℃、5%CO 条件下振荡培养 6 d。
2
体进行倍比稀释，每孔加入 100 µL，37 ℃ 孵育 1 h。 收集培养上清液，经 0.22 μm 滤膜过滤后，参照
洗涤后加入辣根过氧化物酶（Horseradish peroxi- 1.3 节所述 Protein A 亲和层析方法进行抗体纯化。
dase，HRP）标记山羊抗兔 IgG（H+L） （1∶8 000 纯化后的抗体用 SDS-PAGE 和蛋白质免疫印迹
稀释，100 µL/孔）37 ℃ 孵育 45 min。经 PBST 洗涤 （Western blot）进行初步分析，并通过 ELISA 测
3 次后，每孔加入 100 µL 3, 3’, 5, 5’- 四甲基联苯胺 定其效价（方法同 1.5 节） ，抗体整体制备流程如
（3, 3’, 5, 5’-Tetramethylbenzidine，TMB）底物反应 图 1 所示。
5~10 min，最后加入 100 µL 2 mol/L 硫酸（H SO ） 1.7 单克隆抗体 Western blot 分析
2
4
溶液终止反应。在酶标仪 450 nm 波长下测定各孔 取 GCRV-Ⅱ感染的草鱼脑组织或脑细胞，加
光密度（Optical density，OD）值。 入 RIPA 裂解液 [ 含 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（Phen-
1.6 单 B 细胞筛选、重链轻链扩增测序及抗体表达 ylmethanesulfonyl fluoride，PMSF） 、1% 蛋白酶抑
在第 5 次免疫后的第 7 天处死白兔，无菌条件 制剂混合液（Protease inhibitor cocktail， PIC）] 进
下取出白兔脾脏组织。经机械研磨后，采用淋巴细 行组织匀浆，4 ℃ 静置 2 h，于 4 ℃ 12 000 ×g 离
胞分离液制备单细胞悬液。细胞计数后，通过有限 心 15 min。采用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，
稀释法将细胞接种于 96 细胞培养板中，在含 15% BCA）法测定上清液蛋白质浓度，调整合适浓度
胎牛血清（Foetal bovine serum，FBS）的 RPMI-1640 后，加入适量的 5×蛋白质上样缓冲液，充分混
培养基中 37 ℃、5%CO 条件下培养 15 d。采用 EL- 合，100 ℃ 煮沸 10 min，进行 12% SDS-PAGE 电
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ISA 方法（同 1.5 节）检测培养上清液中抗体的效价。 泳（恒压 100 V，90 min） 。采用半干转法，以 15 A
筛选获得高效价阳性抗体后，使用试剂盒提 恒流转膜 600 s。一抗使用制备的抗 GCRV VP4 蛋
取细胞总 RNA。使用表 1 所示特异性引物，通过 白重组兔单克隆抗体（1∶1 000 稀释） ，室温孵
PCR 分别扩增抗体重链可变区（Variable heavy- 育 1 h，PBST 洗涤 4 次，每次 5 min；二抗使用
chain，VH）和抗体轻链可变区（Variable light- HRP 标记的羊抗兔 IgG（H+L） （1∶10 000 稀释） ，
chain，VL）基因片段。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝 室温孵育 40 min，PBST 洗涤 4 次。采用增强型化
胶电泳进行大小验证后，进行 Sanger 测序分析。 学发光（Enhanced chemiluminescence，ECL）法显
采用双酶切法处理 pcDNA3.1-HCH 和 pcDNA3.1- 影，以兔源 IgG 作为 ISO。