Page 69 - 《渔业研究》2025年第5期

610 渔 业 研 究 第 47 卷

已成为当前中国草鱼大规模发病和死亡的主要流行 蛋白预制胶（ACE，韩国） ；Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和
株 [6] ，对 1 龄及以下的草鱼群体的致死率超过 BamH Ⅰ限制性内切酶（NEB，美国） ；抗荧光淬
[7]
80% 。该亚型毒株同时具有水平传播（水体/寄生虫 灭封片剂（碧云天，中国） 。
媒介）与垂直传播（亲本）双重途径，并能建立潜伏 细胞培养箱、酶标仪（Thermo Fisher Scien-
感染，当水温在 28 ℃ 及以上时容易引起急性暴 tific，美国） ；电转仪、电转槽（TANON，中国） ；
[8]
发，死亡率较高 。基于此，建立精准的 GCRV 早 凝胶成像系统（Bio-Rad，美国） ；Amersham Image-
期诊断体系已成为草鱼出血病综合防控的迫切需求。 Quant 800 蛋白印迹成像系统（Cytiva，英国） 。
在疫病诊断技术领域，单克隆抗体凭借其高度 1.3 VP4 真核表达及纯化
特异性的优势，在水产动物及哺乳类动物各类疾病 本研究基于 GenBank 中 GCRV YX246 株 S6
[9]
诊断中具有重要的应用价值 。然而，当前针对 基因序列（基因登录号：PQ553631.1） ，通过基因
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GCRV-Ⅱ单克隆抗体的研究尚处于起步阶段，现有 合成获得编码 VP4 蛋白 A ~S 650 片段的基因序
报道多聚焦于病毒结构蛋白 VP4、VP35 以及 VP7 列。设计特异性引物（表 1） ，以该基因为模板，
的抗原特性分析 [10-11] 。值得注意的是，GCRV-Ⅱ 采 用 50 µL 聚 合 酶 链 式 反 应 （ Polymerase chain
S6 基因编码的 VP4 蛋白作为主要衣壳蛋白，具有 reaction ，PCR）反应体系 [ 含 1 μL 上下游引物、
强免疫原性特征，其在不同分离株间的高度保守性 1 μL 互补脱氧核糖核酸（Complementary deoxyribo-
为建立 GCRV-Ⅱ免疫检测方法提供了理论基础 [12-13] 。 nucleic acid，cDNA）模板、5 μL 10×Pfu Buffer] 进
相较于传统杂交瘤制备技术，新兴的单个 B 细胞 行扩增。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，55 ℃
抗体制备技术有着高效便捷、丰富稳定的优点，在 2 min，72 ℃ 1 min 循环 25 次，72 ℃ 10 min。扩
水产病原检测领域展现出显著的应用潜力，但目前 增产物经 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ双酶切位点克隆至
该技术在水生病毒领域的应用研究不足。因此，本 pTT5-hFc 载体，转化至 TOP10 感受态细胞，经菌
研究以病毒 VP4 蛋白为免疫原，结合单个 B 细胞 落 PCR 筛选阳性克隆并进行测序验证，获得正确
抗体制备技术和 HEK293 真核表达系统制备重组单 构建的重组表达质粒。随后，将阳性质粒转染至
克隆抗体，旨在为 GCRV-Ⅱ病毒快速诊断试剂盒 HEK293F 细胞，经 37 ℃、130 r/min 培养 6 d，收
的开发和 VP4 蛋白功能解析等相关研究提供关键 集培养上清液，经 12 000 ×g 离心和 0.22 µm 滤膜
的工具与技术支撑。 过滤。采用 Protein A 亲和层析纯化：首先用磷酸
缓冲盐溶液（Phosphate buffered saline，PBS，pH=
1 材料与方法
7.4） 平 衡 层 析 柱 ， 上 样 后 以 PBS 洗 涤 至 基 线
1.1 试验动物、病毒、细胞和质粒 平衡，再用 0.1 mol/L 甘氨酸（pH=3.0）洗脱，并

4 月龄雌性新西兰大耳白兔（以下简称白兔） 立即用 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 [Tris
由武汉万千佳兴生物科技有限公司提供，平均体质 (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride，Tris-
量为（2.1±0.2）kg；GCRV-YX246 毒株由本实验 Cl，pH=8.5] 中和。收集洗脱组分，获得纯化重组
室分离保存；HEK-293F 细胞、TOP10 感受态细胞。 VP4 蛋白，通过十二烷基硫酸钠−聚丙烯酰胺凝胶
抗体重组表达载体 pcDNA3.1-HCH 和 pcDNA3.1- 电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel ele-
LCH 为本实验室改造保存（Thermo Fisher Scientific， ctrophoresis，SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析
美国） ；真核表达载体 pTT5-hFc 为本实验室改造 显示其纯度。
保存。中国科学院水生生物研究所伦理审查委员会 1.4 免疫动物
批准动物实验，批准编号为 IHB-LL-2024044。 采用纯化的重组 VP4 蛋白对 4 月龄健康雌性
1.2 主要试剂和实验仪器 白兔进行皮下免疫，在初次免疫时，将 200 µg 重
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（Sigma，美 组 VP4 蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，
国） ；Protein A Beads（常州天地人和生物科技， 采用皮下多点注射方式接种；随后每隔 14 d 进行
中国） ；HRP 标记山羊抗兔二抗（Jackson，美国） ； 加强免疫，共 4 次，每次使用 200 µg 重组 VP4 蛋
Cy3 标 记 羊 抗 兔 IgG（ H+L） （ Abcom， 中 国 ） ； 白与等体积弗氏不完全佐剂乳化后，以相同剂量
Ni Sepharose（GE，美国） ；Ni-NTA Agarose（Invi- 和接种方式进行注射。整个免疫过程中，严格保持
trogen，美国） ；FreeStyle 293 Expression Medium、 每次免疫时间间隔和剂量的一致性。在第 5 次免疫

RPMI-1640 培养基（Thermo，美国） ；FuturePAGE 后的第 7 天采集白兔全血样本，静置离心后分离血