Page 74 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 孔维光等： Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒 VP4 兔源单克隆抗体的制备和鉴定 615

2.4 重组单克隆抗体的表达纯化 1 2 3 4
250
对筛选获得的三株阳性 B 细胞克隆（1H1、1D5
130
和 1F9）进行总 RNA 提取，通过 PCR 扩增其 VH
100
和 VL 基因。利用同源重组分别将纯化的 VH 和 70
VL 基因片段克隆至 pcDNA3.1-HCH 和 pcDNA3.1- 分子量/kDa Molecular weight 55 重链
LCH 载体上，成功构建了重组表达载体。将重组 Heavy chain
质粒转染至 HEK293F 细胞，并进行重组单克隆抗
35
轻链
体表达纯化，SDS-PAGE 分析结果（图 5）显示， 25 Light chain
纯化的单克隆抗体在还原条件下呈现预期大小的
15
重链（约 50 kDa）和轻链（约 25 kDa）条带，纯
图 5 纯化的重组抗体 SDS-PAGE 分析
度>95%，证实成功获得高纯度的三株单克隆抗体
Fig. 5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant
（1D5、1F9、1H1） 。
antibody
2.5 重组单克隆抗体的效价
注：泳道 1. 蛋白质分子量标准；泳道 2. 1D5；泳道 3.
利用 ELISA 方法检测重组单克隆抗体的抗体
1F9；泳道 4. 1H1。
效价，结果如图 6 所示，三株重组单克隆抗体 Notes: Lane 1. Protein molecular weight marker; Lane 2.
1D5、1F9 和 1H1 的抗体效价均达到 1∶128 000。 1D5; Lane 3. 1F9; Lane 4. 1H1.

1.5

1.0
OD 值 OD value

0.5 1D5
1F9
1H1
0
1∶2 000 1∶4 000 1∶8 000 1∶16 000 1∶32 000 1∶64 000 1∶128 000 空白对照
血清稀释度 Blank control
Dilution ratio of serum
图 6 重组单克隆抗体效价 ELISA 检测
Fig. 6 Detection of antibody titer of recombinant monoclonal antibody by ELISA

2.6 重组单克隆抗体对 GCRV-YX246 病毒的反 果均证实，1D5、1F9 和 1H1 单克隆抗体能够特异
应性 性识别 GCRV-YX246 病毒抗原，且具有优异的反
采用 Western blot 技术对重组单克隆抗体的特 应活性，为后续 GCRV-Ⅱ病毒的检测与防控研究
异性进行分析，结果（图 7）显示， 三株重组单 提供了可靠的抗体工具。
抗（1D5、1F9 和 1H1）均能在 GCRV-YX246 感染
3 讨论
细胞本中检测到单一的特异性条带，分子量约为
65.4 kDa，与预期的 VP4 蛋白大小相符；而 ISO 组 由 GCRV-Ⅱ引起的草鱼出血病严重危害中国
未检测到相应的条带，证实了这些单克隆抗体对 草鱼的健康养殖，鉴于目前尚无针对 GCRV-Ⅱ的
GCRV 病毒抗原具有特异的识别能力。 特异性抗病毒药物，开展早期疫情监测和诊断已成
进一步通过组织 IF 评估 1D5、1F9 和 1H1 三 为阻断该病传播的关键性防控举措 [14] 。目前针对
株重组单克隆抗体的抗原识别特性，结果（图 8） GCRV 的检测手段比较有限，主要是常规 PCR、
显示，在 GCRV-YX246 感染的草鱼头肾组织中， 实时荧光定量 PCR 及核酸探针检测法等分子诊断
三株单抗均呈现显著的特异性荧光信号；而阴性对 技术，虽然具有较高的灵敏度，但其对实验室专业
照样本和 ISO 组均未检测到明显荧光信号。这些结 仪器设备的依赖性及复杂的操作流程，难以满足多