Page 80 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 李培君等： 贝类高致病性溶珊瑚弧菌关键毒力因子的鉴定与分析 621

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以上 。同时，中国也是世界上受贝类疫病影响较 导致幼虫全部死亡，并伴随软体组织消解等典型急
为严重的国家， 《2024 中国水生动物卫生状况报 性发病特征。由此可见，这三株溶珊瑚弧菌的致病
告》中的数据显示，2023 年因贝类疾病造成的经 力显著高于常见弧菌对贝类幼虫的作用水平。
济损失达 160.5 亿元，约占水产养殖总损失的 32.2%， 现有研究表明，溶珊瑚弧菌的高毒力表型与其
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是所有养殖种类中损失最大的 。随着贝类养殖产 分泌的胞外锌金属蛋白酶（VcpA、VcpB） 、转录
业不断壮大，对人工培育苗种的依赖越来越强，苗 调控因子（VcpR）及溶血素（VchA）等因子相
种的稳定供应是保障贝类养殖产业健康发展的基 关 [28-32] 。本研究使用的三株溶珊瑚弧菌在表现出强
础。近年来贝类人工育苗病害频发，轻则导致生产 致病力的同时，在浸浴试验初期（12 h）即表现出强
成本增加，重则无法满足下游贝类养殖产业的苗种 溶解活性，推测可能主要源于胞外产物（Extracellular
需求。2024 年中国海水贝类育苗量为 39 837.8 亿万 products，ECPs）中具强细胞毒性和溶解活性的外
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粒，较 2023 年的 40 638.9 亿万粒，下降 1.97% 。 毒素或金属蛋白酶。为验证此假说，本研究通过理
贝类育苗期的病害发生受多种因素影响，其中 化特性检测、ECPs 酶活性测定及 ECPs 蛋白质谱
病原微生物 [4-5] 无疑是核心诱因，而亲贝性腺发育状 分 析 等 技 术 ， 重 点 研 究 了 这 三 株 溶 珊 瑚 弧 菌
态、海区水质环境（如污染、盐度、温度波动） [6-8] ECPs 中的主要毒力因子组成，旨在初步阐明其对
等条件则显著影响着育苗系统的抗病力与病原的致 贝类幼虫的致死机制，为中国贝类育苗期弧菌病的
病性。与育苗期病害相关的病原微生物主要有两大 有效防控提供依据和参考。
类：病毒性病原和细菌性病原。其中，细菌性病原
1 材料与方法
中的致病性弧菌在多种贝类育苗过程中引发的病害
极其普遍且危害严重。作为水产动物的主要细菌性 1.1 菌种来源
病原 [9-11] ，已有大量研究证实多种弧菌与贝类育苗 实验所用的溶珊瑚弧菌由实验室从患病贝类幼
场突发性大规模死亡事件存在紧密关联 [12-14] ，如河 虫中分离获得：菌株 RSH02 和 RSH16、RSH08 分
口弧菌（V. aestuarianus） [15-17] 、塔氏弧菌（V. tubia- 别分离自 2024 年 2 月山东省滨州市无棣县和烟台
shi） [18-19] 、溶珊瑚弧菌（V. coralliilyticus） [18, 20-21] 市牟平区发生大规模死亡的长牡蛎幼虫；菌株
以及溶藻弧菌（V. alginolyticus） [22-23] 等，它们已 RSH05 分离自 2024 年 3 月江苏省南通市育苗场采
在全球范围内给贝类育苗产业带来了巨大的经济损 集的发病菲律宾蛤仔幼虫。所用菌株均冻存于−80 ℃
失。近年来，中国贝类育苗过程中弧菌病导致的规 备用。
模性死亡事件频发，影响范围广，易感宿主多样， 1.2 菌株生长曲线测定
如副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）引发杂色鲍 将保藏菌株分别划线接种于 2216E 琼脂培养
（Haliotis diversicolor supertexta）幼虫大规模死 基，28 ℃ 培养 24 h。挑取单菌落，转接于含有 8 mL
亡 [24-25] ； 溶 藻 弧 菌 、 地 中 海 弧 菌 （ V. mediterr- 2216E 培养基的摇菌管中，28 ℃、160 r/min 振荡
anei） [26] 和灿烂弧菌（V. splendidus） [27] 也被鉴定 培养 12 h，将上述活化菌液转接至大体积 2216E 培养

为长牡蛎（Crassostrea gigas） 、缢蛏（Sinonova- 基中扩大培养至对数期，当 OD 60 0 为 1.0 时（菌液浓
cula constricta） 、熊本牡蛎（C. sikamea） 、菲律 度为 10 CFU/mL）为目标菌液。将目标菌液分别稀
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宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）等贝类幼虫的常 释成 10 、10 、10 CFU/mL 后，各取 10 μL 点样于装
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见病原。 有 190 μL 2216E 培养基的蜂窝板板孔（BIOSCREEN，
本研究基于前期筛选自中国贝类育苗场大规模 规格：100 孔/块）中，每个梯度 3 个重复，采用微
死亡案例的三株高致病性溶珊瑚弧菌（RSH02、 生物高通量生长曲线测定仪（Bioscreen C）在 28 ℃
RSH05 和 RSH08） ， 经 全 基 因 组 ANI（ Average 条件下培养 24 h，测定菌株的 24 h 的生长曲线。
nucleotide identity）分析鉴定其分类地位，并通过 1.3 ECPs 制备
回感实验验证致病性。在多种双壳贝类 [ 长牡蛎、 用平板玻璃纸法 [33] 制备 ECPs。取对数生长期
近江牡蛎（C. ariakensis） 、白蛤（Mactra quadran- 的三株目标菌液 200 μL，均匀涂布于铺有无菌玻璃
gularis）] 幼虫回感实验中，三株致病菌的半数致 纸的 2216E 琼脂培养基平板上，28 ℃ 培养 24 h。
死浓度（LC ）均低至 1×10 ~ 10 CFU/mL（以致 每平板用 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L
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死率较弱的菌株 RSH16 作为对照组） ，在 12 h 内 pH 7.2）洗涤菌体，收集菌悬液。将收集的菌悬液