Page 81 - 《渔业研究》2025年第5期
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              于  4 ℃、14 000 r/min  离心  20 min，取上清液。上           兰氏染色中呈红色，为革兰氏阴性菌（图                    1） 。经
              清液依次经       0.45 μm  和  0.22 μm  微孔滤膜过滤除         血平板及     CAS  铁载体培养基      24 h  培养结果表明：
              菌，所得滤液即为          ECPs 粗提液。ECPs 粗提液经             供试的三株病原菌（RSH02、RSH05、RSH08）均
              平板涂布培养验证无菌后，低温保存备用。每次使                           具备溶血素及嗜铁素产生能力。在血平板上，三株
              用前，采用      BCA  蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云                   菌落周围均出现透明无色的溶血环，呈现典型的
              天生物技术有限公司，货号             P0012S）测定   ECPs 粗      β  溶血现象，其中      RSH02  的溶血环最为显著；在
              提液的蛋白质浓度。                                        CAS  检测平板上，均观察到明显黄色透明圈，证
               1.4 ECPs 蛋白相对分子量测定                              实其具备嗜铁素合成能力。
                  以采用十二烷基硫酸钠−聚丙烯酰胺凝胶电泳                             由图  2  可知，基于    OD 60 0  测量值绘制的生长曲
              （SDS-PAGE）测定       ECPs 中蛋白质的相对分子                线显示，这三株溶珊瑚弧菌的生长趋势基本一致。
              量。将    ECPs 与  5×SDS-PAGE  上样缓冲液（loading         0~8 h  为  RSH02、RSH05、RSH08   生长停滞期，此
              buffer）按  5∶1  混匀，煮沸     10 min，冷却后加样，           时 期 活 菌 数 变 化 相 对 较 小 ； 8~24  h   为  RSH02、
              每孔加    20 μL  样品，并加点     Marker（赛默飞世尔科           RSH05、RSH08   对数生长期，此时期营养物质丰
              技公司） 。采用       Tris-甘氨酸（Tris-Glycine）电泳          富、细胞生长旺盛。
              缓冲液，室温条件下进行电泳。SDS-PAGE                浓度为         2.2 胞外蛋白鉴定
              分离胶    15%、浓缩胶     5%，浓缩胶部分恒定电压为                     根据平板结果来看，预测这三株高毒力菌的
              120 V，分离胶部分恒定电压为              90 V。电泳结束          致病机制主要为       ECPs 中含有蛋白酶类的蛋白，具
              后，凝胶经考马斯亮蓝快速染色液染色后，用生物                           有较强水解蛋白质的能力。结合这三株溶珊瑚
              分子成像仪（GE ImageGuant       TM  LAS 4 000）获取凝      弧菌  ECPs 的  SDS-PAGE  图谱（图     3） ，发现这三
                                     TM
              胶图像，利用       ImageGuant  LAS 4 000  软件分析各        株菌图谱不完全相同，仅分子量为                35 kDa 的蛋白
              分离蛋白的相对分子量。                                      条带是菌株      RSH02、RSH05、RSH08     共有的。由
               1.5 ECPs 蛋白测序                                   此猜测，RSH02、RSH05、RSH08          有不同的致病
                  从  1.4  所得的同一浓度     ECPs 样本对应的      SDS-     策略。因此，将致死率较弱的菌株                  RSH16  作为
              PAGE  凝胶电泳切割胶条送至生工生物工程（上                         对照组，切割特定条带分析菌株               RSH02、RSH05、
              海）股份有限公司进行基质辅助激光解吸电离和串                           RSH08  的  ECPs 蛋 白 成 分 ， 进 一 步 研 究 其 致 病
              联飞行时间质量分析器（Maldi-TOF-TOF）测序。                     机制。
               1.6 平板验证                                            从蛋白质谱定性结果中可以发现（表                1） ，这三
                  参照   Schwyn  等 [34]  和沈桂明等 [35]  的方法，将       株菌的   ECPs 中共同存在的蛋白含有水解蛋白质的
              菌株的     ECPs 分别接种到蛋白酶（含             10%  脱脂      能力，存在显著高活性的氨肽酶（A0AAN0S9Y5） 、
              奶） 、溶血素（含       7%  绵羊脱纤维血）鉴定培养基和                肽 酶  M4（ A0AAN0SH43） 、 中 性 金 属 蛋 白 酶
              嗜铁素检测培养基（CAS           检测培养基）中，28 ℃              （I3QI58） ，与预测结果相符合。菌株              RSH02  鉴
              培养   24 h  后观察菌落周围是否产生明显的显色                      定到  7  个毒力相关蛋白，涵盖降解宿主防御、组织
              圈。经滴加氯化汞溶液后，观察蛋白酶鉴定培养基                           侵袭、氧化应激防护等功能；菌株                RSH05  鉴定到
              是否出现透明圈；直接观察溶血素鉴定培养基是否                           8  个毒力相关蛋白，新增铁转运蛋白和外膜蛋白功
              出现溶血圈；直接观察           CAS  检测培养基是否出现              能；菌株    RSH08  鉴定到    7  个毒力相关蛋白，新增
              黄色透明圈。                                           宿主黏附膜蛋白和毒力前体加工肽酶。
                                                                2.3 蛋白定量参数差异
               2 结果与分析
                                                                   在覆盖率与丰度差异（表           2~表  4）中可知，菌
               2.1 菌株的形态特征与生长特性                                株  RSH02  在氨肽酶（15%） 、细菌铁蛋白（29%）
                  28 ℃  培养  24 h  后，三株溶珊瑚弧菌在         2216E     上显著高于其他菌株；菌株              RSH08  在外膜蛋白
              琼脂培养基上的菌落为圆形、略微凸起、湿润光滑                           （20%）和中性金属蛋白酶（5%）覆盖率突出；
              且边缘整齐的乳白色菌落，大小为                  1~2 mm；在        菌株  RSH05  多数蛋白覆盖率偏低（铁转运蛋白仅
              TCBS  培养基上的菌落为圆形、略微凸起、湿润光                        5%） 。然而，在肽段-谱图匹配数（Peptide-spectrum
              滑且边缘整齐的黄色菌落，大小为                 1~2 mm；在革        matches，PSMs）中发现，肽酶       M4（A0AAN0SH43）
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