Page 118 - 《水产学报》2026年第04期

4 期 吕 丁，等：基于环境 DNA 的黄河口与长江口邻近海域鱼类多样性比较 50 卷

采用 Qiagen DNeasy 组织与血液 DNA 提取试 在所有阴性对照中最高相对丰度的 10 倍，则于该
剂盒 (Qiagen, 荷兰)，并按照试剂盒操作手册说明 样本中将其剔除，以校正痕量背景污染；将任何
提取 DNA。提取后的 DNA 使用 NanoDrop One 微 样本中读段数 ≤ 5 的物种判定为假阳性，并将其
量分光光度计 (Thermo Fisher Scientific，美国) 进 丰度设为零，以排除潜在假阳性。通过上述质量
行定量，于−80 ℃ 保存备用。 控制环节，最终获得用于后续分析的 ASV。所有
样本均进行 3 次独立的 PCR 及测序重复，后续分
1.2 PCR 扩增与高通量测序
析中，各 ASV 的丰度取其 3 次重复读段数的平均数。
目标扩增片段为鱼类 12S rRNA 基因的部分
1.4 物种注释与统计分析
序 列 ， 采 用 通 用 引 物 MiFish-U-F (5 ′ -[Barcode]-
针对各 ASV 的代表性序列，利用 BLASTn
GTTGGTAAATCTCGTGCCAGC-3 ′ ) 和 MiFish-U-
算法 (v2.2.30) 与 NCBI GenBank 及 Mitofish 数据
R (5′-[Barcode]-CATAGTGGGGTATCTAATCCTA-
[7]
GTTTG-3′) ，该引物可特异性扩增鱼类 12S rRNA 库 进 行 比 对 ， 实 现 物 种 分 类 注 释 。 将 e 值 ≤
基因特定区域，适用于鱼类物种鉴定。引物中的 1×10 −10 且相似度 ≥ 97% 的比对结果视作有效。
所有统计分析在 R (v4.3.2) 环境中完成 。首先，
[12]
[Barcode] 为 8 碱基特异性序列，用于在混合测序
为消除测序深度差异对多样性比较的影响，本实
后区分不同样本。PCR 反应程序：95 ℃ 5 min；
验基于最终的 ASV 表，使用 vegan 包中的 rrarefy
95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30 个循环；72 ℃
函数将所有样本的序列数随机重抽样至统一深度，
终延伸 5 min。扩增产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳分
后续分析均基于此标准化后的 ASV 表进行。其中，
离后，使用 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 (Axy-
gen Biosciences，美国) 进行纯化。以上纯化产 Chao1、Shannon 和 Simpson 指数分别使用 vegan
包 (v2.6-4) 中的 estimateR 与 diversity 函数计算。
物作为模板，使用 Illumina Nextera XT Index Kit V2
此外，实验计算了 Pielou 指数，其定义为 J’ = H’ /
(Illumina，美国) 中的索引引物进行第二轮 PCR，
lnS，其中 H’为 Shannon 指数，S 为观测物种数
以添加完整测序接头。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃
(即 ASV 数量)。为比较黄河口与长江口区域间的
30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10 个循环；72 ℃
Alpha 多样性差异，实验对 2 个区域各站位独立计
终延伸 5 min。第二轮 PCR 产物经相同方法纯
算出的上述指数，采用独立样本 t 检验进行统计
化、定量后，按等摩尔比混合构建最终测序文库。
分析 (当样本量较小时，采用 Wilcoxon 秩和检验)。
纯化产物通过 Qubit® 3.0 荧光计 (Life Invitro-
Beta 多样性分析基于 Bray-Curtis 距离相异度矩阵
gen，美国) 进行定量。将带有不同 Barcode 的每
进行，该矩阵通过 R 语言 vegan 包 (v2.6-4) 中的
®
24 个扩增子按等量混合，并依照 NEXTFLEX DNA
vegdist 函数计算。采用 vegan 包中的 metaMDS 函
建库试剂盒 (NEB，美国) 说明书构建双末端测序
数进行非度量多维尺度分析 (NMDS) 可视化，并
文库。文库最终在 Illumina MiSeq PE 250 平台 (上
运用 vegan 包中的 anosim 函数进行相似性分析
海凌恩生物科技有限公司) 上进行双末端测序。
(ANOSIM)，以检验两大河口鱼类群落结构的差异
1.3 序列数据处理与质控 是否具有统计学显著性。所有统计图表均使用
对下机原始数据开展质控处理。通过 Trim- ggplot2 包进行绘制。考虑到黄河口与长江口采样
momatic (v0.39) [9] 剔除低质量读段 (参数：LEAD- 水层数存在差异 (前者为表层和底层，后者为表层、
中层和底层)，为消除因采样设计不同可能带来的
ING:20, TRAILING:20, SLIDINGWINDOW:4:20,
MINLEN:50)；使用 FLASH2 (v1.2.10) [10] 将成对末 潜在偏差，特别是确保跨区域比较的公平性，本
端读段进行拼接 (最小重叠 10 bp，最大重叠 200 研究采取了以下分析策略：在描述性分析中，计
bp，最大错配率 10%)。后续分析在 QIIME2 环境 算了各站位基于所有水层的多样性指数；同时计
中进行。使用 DADA2 (v1.24.0) [11] 进行去噪、去 算了可比数据子集的指数，即长江口数据仅使用
冗余并去除嵌合体序列，最终获得高质量的扩增 其表层和底层水样，与黄河口采样设计保持一致。
子序列变体 (ASV)。 2 结果
为最大限度地减少假阳性信号，对 ASV 表进
行多级过滤：移除所有样本中仅出现一次的 ASV
2.1 高通量测序结果
以去除高概率的测序错误，并将其与阴性对照对
比，若某 ASV 在真实样本中的相对丰度未达到其 所有 45 个样本均成功提取 eDNA 并完成高

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