Page 20 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 钟照威，等：日本鳗鲡性腺细胞系高效构建及其应用 50 卷

表 2 基因扩增、质粒构建及定量引物序列
Tab. 2 Primer sequences for gene amplification, plasmid construction, and quantification
用途 基因名称 正向引物序列(5'→3') 反向引物序列(5'→3') 基因号
usage gene name forward primer(5'→3') reverse primer(5'→3') gene number
PCR COI GACAACGCCACATTAACCC ATTAAGCTACTAGGGCTTATCA AF479272.1
foxl2 TTCGTCGGAAGCTCATGGTC CGGGCTACTGTTGTGAGACA XM_035388998.1
dnd GGAGTCATGGGTGCAAAGGA TGGCCGCTGAAGTTCATCAT XM_035411270.1
sox3 TACCGACCACGCAGAAAGAC TGTTCATGCTGGGATGCTGT XM_064329192.1
dmrt1 CAACTTCTACCAGCCCTCCC GAACTGGTCTCGCACTCCTG XM_064307028.1
amh CAGAGGAGAGAGCTGACCCT GGAAGTGGAAAGTCCGGGAG XM_035412259.1
nanog CAGCGTTCTCAGAGGACCAG GTACCTCTCCGAAACCCAGC XM_064331232.1
qRT-PCR klf4 GATGTGTCCCCTTCTGGTGG CAGGTGAAGGGCAGAGTGAG XM_064297443.1
sox2 CTTAACGCTCACAACACGGC GGATTTTACCACCGAGCCCA XM_035413087.1
oct4 CGGCGTCTACTATTCGACCC TCTCTTTGTGTGTACCCGCC XM_035390140.1
cmyc CCACAGCCCTCTCGTTTTGA GCTGGTGCATTTTCGGTTGT XM_064330823.1
nanog CAGCGTTCTCAGAGGACCAG GTACCTCTCCGAAACCCAGC XM_064331232.1
lin28a TGTTCGTCCACCAGAGCAAG TGAAGGAGTAGCCACGCTCTGT XM_047357599.1
lin28b TCCCCCTTTGGATGTGTTCG AGGTCTCCTCTCACTCCCTG XM_064342918.1
wnt3a GAACTTCGCCCAACTTCTGC GTATTTACGGATCAGACCGTGTC XM_064315886.1
gapdh GCCAGCCAGAACATCATC GACACGGAAAGCCATACC XM_064310421.1
plasmid nanog aattctgcagtcgacggtaccATGTCTGAAAGACC atggtggcgaccggtggatcccgTTAACTGGTCAG XM_064331232.1
construction GCAGAGTCC GTGACCCA
oct4 aattctgcagtcgacggtaccATGTCTGAAAGACC atggtggcgaccggtggatcccgTTAACTGGTCAG XM_035390140.1
GCAGAGTCC GTGACCCA
lin28a aattctgcagtcgacggtaccATGTGTCCAACCAG aatggtggcgaccggtggatcccgATCAGAGCTCT XM_047357599.1
TTGCGAC CTGGAGGC
lin28b aattctgcagtcgacggtaccATGAGTACAAGAA atggtggcgaccggtggatcccgGGTCTTTTTCCTC XM_064342918.1
AAACTATTCCGTCA TTCTGG
dsRNA nanog CACACTTTCCAGGTTCCGTT AAGTGAGGCCGGTTAGACCT XM_064331232.1
注：红色字体为酶切位点；蓝色字体为保护碱基，防止移码突变。
Notes: Restriction sites are shown in red. Blue fonts are used to protect bases and prevent frameshift mutations.
观察细胞活力变化，实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 形成纤维样细胞迁出 (图版Ⅱ-1)；培养至第 5 天，
检测多能性相关基因的表达水平，从而验证性腺 组织块周围细胞聚集增多，形成单层贴壁区域，
细胞系在基因功能研究中的适用性。 迁出细胞密度增加，形态呈短梭形 (图版Ⅱ-2)；

1.8 数据分析 约 10 d 后，细胞长满单层，采用胰蛋白酶消化法，
以 1∶2 的比例进行首次传代。早期代次 (P1~P5)，
使用 Image J 软件进行 EGFP 阳性细胞计数并
细胞形态主要为短梭形、纺锤形或不规则形，密
计算细胞转染效率；使用 SPSS 27.0 对实验数
度较低，空间分布利于生长 (图版Ⅱ-3~4)；中期代
据进行分析，所得数据以平均值±标准差 (mean±
次 (P15~P30)，细胞生长速率加快，形态舒展 (图
SD) 表示，采用单因子方差分析 (One-Way ANOVA)；
图表使用 GraphPad Prism 8 和 Adobe Illustrator 2023 版Ⅱ-5~8)；稳定传代阶段 (P30~P120)，细胞生长
软件进行处理。 状态良好，增殖速率进一步加快，培养密度较高，
细胞形态稳定，以短梭形为主，其间常伴少量卵
2 结果 圆形细胞 (图版Ⅱ-9~12)。该细胞系已稳定传代至

第 120 代，命名为日本鳗鲡卵巢组织细胞系 (A.
2.1 细胞系的建立 japonica ovarian tissue cell line，AJOTCL)。

日本鳗鲡卵巢组织块接种后第 3 天，可见梭 日本鳗鲡精巢组织块接种后第 5 天，开始有

中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
5