Page 17 - 《水产学报》2026年第3期
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3 期                                     水    产    学    报                                 50 卷

                                               [2]
              璃鳗、幼鳗、黄鳗及银鳗共             6  个阶段 。迄今，鳗            靠的体外模型，也为不同鱼类细胞系构建提供
              苗规模化全人工繁育仍然是世界性难题，养殖苗                            借鉴。
              种全部依赖天然捕捞。虽然国内外学者在实验室
                                                                1    材料与方法
              已人工培育出日本鳗鲡            (Anguilla japonica) 初孵仔
              鱼，但由于其低产量和高培育成本，无法实现商
                                                                1.1    实验对象及材料
                       [3]
              业化生产 ，且催熟催产亲鱼虽然怀卵量大但完
              全成熟的卵子比例很低、产卵量很少 。因此，                                健康的日本鳗鲡由福建省南平市泽汇渔业                   (光
                                                 [4]
              攻克鳗鲡人工繁育技术难关，获得稳定的鳗苗供                            泽) 有限公司提供，4        尾雌鱼    [(420±60) g]、4  尾雄
              给是解决鳗鲡产业发展瓶颈的首要任务，也是国                            鱼  [(200±50) g]。细胞实验前，雌雄鱼分别在含
              家种业振兴战略的重要支撑。                                    三 抗  (100  U/mL  青 霉 素 、 100  μg/mL  链 霉 素 及
                   细胞培养为开展鱼类细胞生物学、毒理学、                         100 μg/mL  两性霉素   B) 的灭菌海水中暂养         1~2 h，
              病理学、遗传学分析等研究提供了重要的体外模                            然后滴入     3~4  滴丁香酚   (丁香酚占灭菌海水体积
              型 。相较于活体实验，细胞水平实验可有效规                            0.005%~0.015%)，直至鱼体对刺激无应激行为后，
                [5]
              避诸多限制因素，并展现出相对较好的可重复性。                           解剖提取组织样本用于后续原代细胞培养。
              该 领 域 的 研 究 始 于     Wolf 等  [6]  首 次 建 立 的 虹 鳟       L15  细胞培养液购自上海富衡生物科技有限
              (Oncorhynchus mykiss) 性腺细胞系，这也是首株被               公司，生长因子购自派普泰克生物科技                   (苏州) 有
              报道的鱼类细胞系。此后，陆续从多种鱼类组织                            限公司，RNA      提取试剂盒、cDNA        合成试剂盒及
              中分离培养了细胞系，例如大菱鲆                  (Scophthalmus   所有引物均由生工生物工程             (上海) 股份有限公司
                                                [7]
              maximus) 肌 肉 成 纤 维 细 胞 样 细 胞 系 、 大 黄 鱼           合成。参照课题组前期发表的方法                [13]  分别提取日
                                                               本鳗鲡血清      (AJ-FS) 及日本鳗鲡胚胎提取物           (AJ-
              (Larimichthys crocea) 肌肉细胞系 和性腺细胞系         [9]
                                           [8]
                                                               EE)，1 mL/管进行分装，–20℃        储存。配制完全培
              等，并被广泛应用于鱼类生理学、毒理学以及基
                                                               养液Ⅰ和完全培养液Ⅱ，具体成分及比例见表                      1。
              因功能研究等领域。
                                                               细胞培养    (原代至第     15  代) 使用完全培养液Ⅰ进行
                   性腺是鱼类配子发生、性别决定与分化的核
                                                               培养，第     16  代开始更换完全培养液Ⅱ进行培养，
              心器官。建立稳定的性腺细胞系，为在体外、细
                                                               直至细胞系建立。本实验经集美大学实验动物伦
              胞及分子水平上深入研究鱼类性腺发育、配子发
                                                               理委员会批准      (2021-04)，并根据相关指南进行。
              生调控、性别决定通路、激素作用机制等基础生
              物学过程提供了不可替代的平台 ，为揭示鱼类                             1.2    细胞原代与传代培养
                                            [10]
              独特的生殖生物学特性提供了重要支撑。鉴于许                                分别取处理至无反应的日本鳗鲡雌、雄鱼，
              多重要经济鱼类存在显著的性别生长差异，如大                            以浸有   75%  乙醇的纱布擦拭鱼体表           2  次。将鱼体
                   [9]
                                                    [11]
              黄鱼 、尼罗罗非鱼          (Oreochromis niloticus) 、半    移入超净台，解剖取出性腺组织，于含                  100 U/mL
              滑舌鳎    (Cynoglossus semilaevis) ，可以利用性腺          青霉素、100 μg/mL     链霉素及     0.25 μg/mL  两性霉
                                          [12]
              细胞系深入解析性别决定的关键基因与调控通路，                           素  B  的  PBS  溶液中漂洗  3~4  次。通过石蜡组织切
              这为开发更高效的性别控制技术               (如基于基因编辑            片、H.E   染色判断雌雄及发育阶段，取第Ⅱ期卵
              或激素处理的细胞移植)，进而培育单性或多倍体                           巢  (图版Ⅰ-1) 和中期精巢       (图版Ⅰ-2) 用于原代细
              养殖群体，显著提高产量和经济效益奠定了基础。                           胞培养。将性腺组织切为            1 mm 碎块，用含三抗
                                                                                           3
              此外，研究性腺细胞对激素和环境因子                   (如温度、        的  PBS  溶液漂洗   3  次，红细胞裂解液裂解组织附
              光照) 的响应，有助于优化日本鳗鲡的亲鱼培育和                          着的血细胞，再用        PBS  溶液  (含三抗) 清洗    3  次后，
              人工催产技术，提高受精率与苗种质量。然而，                            将组织块均匀铺在细胞培养瓶内，用                 1 mL  完全培
              目前尚无日本鳗鲡性腺组织细胞系的相关报道，                            养液Ⅰ重悬润湿培养瓶底，26 ℃             恒温启动原代培
              极大地限制了对其性腺发育机制的深入探索。                             养；第   2  天加入  1 mL  完全培养液Ⅰ，第        3  天再加
                   本研究拟建立日本鳗鲡的性腺组织细胞系培                         入  1 mL  完全培养液Ⅰ，第       4  天更换培养液，并补
              养体系并开展基于细胞系的基因功能研究，为日                            充  5 mL  完全培养液Ⅰ继续进行原代培养。
              本鳗鲡生长发育、生殖生理、良种选育等提供可                                当贴壁细胞增殖至         80%~90%  瓶底覆盖率时，

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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