Page 19 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 水 产 学 报 50 卷

1 mL 无血清细胞冻存液 (CE70010，ZetaLife，美 培养的性腺细胞系的 DNA，PCR 扩增反应参照前
国)，轻柔吹打重悬细胞，将细胞悬液移入冻存管， 期研究方法进行 。扩增产物经 1.5% 琼脂糖凝胶
[14]
置于程序降温盒 (降温速率：−1 ℃/min) 中−80 ℃ 电泳分析后，使用凝胶成像系统拍照，回收目标
冷冻 24 h 后转移至液氮中长期储存。复苏时从液 条带并送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司进
氮中取出冻存管，立即浸入 40 ℃ 水浴中持续摇 行测序验证。选用 COI 基因作为分子标记进行
晃至完全融化 (≤2 min)，将细胞悬液转移到 15 mL PCR 扩增鉴定细胞系物种来源，检测卵巢特异性
离心管，并加入 5 mL 完全培养液Ⅰ，离心 (1 500 标 记 基 因 (sox3、 foxl2)、 精 巢 特 异 性 标 记 基 因
r/min，5 min) 后弃上清液，细胞沉淀用新鲜完全 (dmrt1、amh) 及生殖细胞标记基因 (nanog、dnd)
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培养基Ⅰ重悬，接种于 25 cm 细胞培养瓶中，26 ℃ 的表达水平来鉴定性腺细胞系的类型。所有引物
培养，24 h 后更换新的完全培养液Ⅰ连续培养， 序列见表 2。
监测贴壁率用于细胞活力分析 (活力>85% 为合格)。
1.5 染色体核型分析
温度对细胞扩增的影响 选取增殖活力
较 好 的 第 10 代 性 腺 细 胞 (P10)， 接 种 于 75 cm 2 取 AJOTCL 和 AJTTCL 分裂旺盛的 P30 细胞，
2
细胞培养瓶，待细胞长满瓶底时，将细胞传至 4 分别接种至 75 cm 细胞培养瓶中，待细胞生长至
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个 25 cm 细胞培养瓶中 (接种密度：1×10 个/mL)， 对数中期，向培养体系中加入秋水仙碱 (终浓度：
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分别在 16、21、26 和 31 ℃ 的恒温培养箱中进行 20 µg/mL)，于 26 ℃ 下处理 4 h 以阻断细胞有丝分
培养，每隔 24 h 使用细胞特征分析仪 (SmartCell 裂于中期。随后，参照前期的研究方法制备有丝
200 A Plus；上海萌薇生物科技有限公司) 进行细 分裂中期染色体标本 ，显微镜 (Panthera S6，麦
[9]
胞计数并作图分析 (0~120 h，每组 n=6)。 克奥迪实业集团有限公司，厦门) 1 000 倍油镜下
不同传代比例对细胞增殖的影响 选取 进行观察，对每个细胞系随机选取的 100 个处于
第 30 代 (P30) AJOTCL 和 AJTTCL 细胞培养 48 h 分裂中期的细胞进行染色体数目计数和统计分析，
(此时细胞状态良好，汇合度接近 90%)，分别以 以确定细胞的染色体众数。
1∶2、1∶3、1∶5、1∶10 的比例进行接种传代培
1.6 转染效率分析
养，每 24 小时计数细胞 (0~120 h，每组 n=6)，收
集处理数据绘制细胞生长曲线，并计算细胞倍增 参照 Xu 等 [9] 的方法，取对数生长期、汇
时间，计算公式： 合度 70%~80% 的 AJOTCL 和 AJTTCL 细胞，将
pEGFP-N1 5 μL DPEC
[ ( ) 质粒 (5.0 μg，溶于 水) 与细
DT = t × lg2/ lgN t −lgN 0
胞悬液 (1 × 10 个细胞，重悬于 25 μL Opti-MEM
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t
式中，DT 为细胞倍增时间，t 为培养时间，N 为
I 培养基) 充分混匀后转移至电击杯 (2 mm) 中，使
t 时间时的细胞数，N 为接种时的细胞数。
0
用脉冲细胞转染系统 (BEX™ CUY21 EDIT Ⅱ™)，
不同 FBS 浓度及不同培养液对细胞增殖的
设置程序参数 (目标电阻：180~200 Ω) 进行电转染，
影响 分别配置含 0%、5%、10%、15%、20%
FBS 浓度的培养液及配制不同成分的完全培养液 转染后的细胞于 26 ℃ 培养 24 h 后，对细胞进行
(M199、MEM、DMEM/F-12、L-15)，取对数生长 DAPI 核染色，并在倒置荧光显微镜 (Eclipse Ei，
期的性腺细胞，消化后接种于 25 cm 细胞培养瓶 Nikon，日本) 下观察 EGFP 的表达，统计 EGFP
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(接种密度：1×10 个/mL)，分别加入含 0%、5%、 阳性细胞比例，确定转染效率。
10%、15%、20% FBS 的培养液，培养 72 h后，计 1.7 基因功能分析
数并作图分析 (每组 n=6)。
参 照 Xu 等 [9] 的 方 法 ， 首 先 体 外 转 录 合 成
细胞长期培养后的存活情况 取汇合度
nanog、egfp 的双链 RNA (dsRNA)，并构建多能性
80%~100% 的性腺细胞，更换为完全培养液 II 后，
因子 nanog、oct4、lin28a、lin28b 的过表达质粒；
置于 26 ℃ 下培养 30 d，再次补给新鲜的完全培
然 后 分 别 在 AJOTCL 和 AJTTCL 细 胞 系 电 转 染
养液Ⅱ，观察细胞存活情况。
nanog、egfp 的 dsRNA 进行 RNA 干扰 (RNAi) 以及
1.4 细胞系的鉴定与验证 多能性因子及 egfp 的过表达实验，其中 egfp 为阴
分别提取日本鳗鲡卵巢组织、精巢组织以及 性对照组，每组有 6 个生物学重复；转染 48 h 后

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