Page 228 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 刘威彤，等：传染性胰脏坏死病毒 (IPNV) 检测及区分 1、5 基因型方法的建立及应用 50 卷

55.0 ℃ 时 产 生 的 C 最 低 ， 显 著 低 于 温 度 高 于 1.4
t
1.3
57.1 ℃ 的组 (图 2)。而 55.0 ℃ 组的 C 值与其他各 1.2
t
1.1
1.0
组 C 值均无显著性差异。因此，当退火温度为 0.9 1 2
t
0.8
0.6
55.0 ℃ 时扩增效果最好，优化后 RT-qPCR 反应条 相对荧光单位 relative fluorescence units 0.7
0.5
0.3
件确定为 94.0 ℃ 预变性 30 s；94.0 ℃ 变性 5 s， 0.4 3 4
0.2
0.1
55.0 ℃ 退火/延伸 20 s，40 个循环。 −0.1 0 NC
0 2 4 6 8 10121416182022242628303234363840
25 b b ab ab a 循环数/个
d cd cd bc
cycles
20
图 3 RT-qPCR 检测 IPNV 的特异性分析
C t 值 C t value 15 1. IPNV 1，2. IPNV 5，3. VHSV，4. IHNV，NC. 阴性对照。
Fig. 3 Specificity analysis of IPNV detected by fluores-
10
cence quantitative PCR
1. IPNV 1, 2. IPNV 5, 3. VHSV, 4. IHNV, NC. negative control.
5
2.4 RT-qPCR 灵敏度
0
55.056.257.158.259.360.461.362.163.0 将 p-IPNV 1 和 p-IPNV 5 进行梯度稀释，在
退火温度/°C 10 ~10 个/μL 拷贝数的浓度范围内进行 RT-qPCR
9
1
annealing temperature
检测。9 个稀释度的质粒均出现典型的“S”型扩增
图 2 不同退火温度条件下的 C t 值
曲线 (图 4)，且样本浓度越高 C 值越小，相邻稀
t
Fig. 2 C t values at different annealing temperatures
释度之间 C 值相差较平均，在最低浓度下依然出
t
2.3 RT-qPCR 特异性 现阳性扩增结果，检测下限均为 10 个/μL 拷贝数。
对 p-IPNV 1 建 立 的 标 准 曲 线 的 回 归 方 程 为
对 IPNV 1、IPNV 5、VHSV 和 IHNV 样本进
2
y=−3.510x+39.38，R =0.999 3，对 p-IPNV 5 建立的
行 RT-qPCR 检测，IPNV 1 和 IPNV 5 的 cDNA 有
2
标 准 曲 线 的 回 归 方 程 为 y=−3.584x+38.93， R =
特异性扩增，C 值分别为 18.39 和 17.54，均出现
t
0.999 3 (图 5)，其中横坐标表示模板浓度的对数，
典 型 的 “S”型 扩 增 曲 线 ， 而 对 IHNV、 VHSV 的 纵坐标表示 C 值。模板浓度对数值与对应的 C t
t
cDNA 无特异性扩增，也未出现典型的扩增曲线 值之间线性关系良好，反应体系稳定。结果表明，
(图 3)。结果表明，本研究设计的 RT-qPCR 引物 RT-qPCR 对 IPNV 1 和 IPNV 5 的检测效率相近，
对于 IPNV 的检测具有良好的特异性。 均具有良好的灵敏度。
1.8 1.8
1.7
1.7
1.6
1.6
1.5
1.5
相对荧光单位 relative fluorescence units 1.3 9 8 7 6 5 4 3 2 相对荧光单位 relative fluorescence units 1.4 9 8 7 6 5 4 3 2
1.4
1.3
1.2
1.2
1.1
1.1
1.0
1.0
0.9
0.9
0.8
0.8
0.7
0.7
0.6
0.6
0.5
0.5
0.4
0.4
1
0.3
0.3
0.2
0.2
1
NC
0.1
0.1
NC
0
−0.1
0 2 4 6 8 10121416182022242628303234363840 −0.1 0 0 2 4 6 8 10121416182022242628303234363840
循环数/个 循环数/个
cycles cycles
(a) (b)
图 4 RT-qPCR 检测 IPNV 的灵敏度测试
1
9
(a) p-IPNV 1 质粒各浓度下 RT-qPCR 的 C t 值，(b) p-IPNV 5 质粒各浓度下 RT-qPCR 的 C t 值；1~9. 标准品质粒浓度 10 ~10 个/μL 拷贝数，
NC. 阴性对照。
Fig. 4 Sensitivity detection of IPNV by fluorescence quantitative PCR
(a) C t values of RT-qPCR at different concentrations of p-IPNV 1, (b) C t values of RT-qPCR at different concentrations of p-IPNV 5; 1-9. standard plas-
9
1
mid concentration 10 -10 copies /μL, NC. negative control.
中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
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