Page 227 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 水 产 学 报 50 卷

释度质粒为模板，采用 20 μL 反应体系进行 RT- 样本使用 IPNV 5 特异性检测引物扩增出 543 bp
qPCR 扩增，其中 2×Premix Ex Taq 10 μL，引物各 条带，则判定为 5 型。
1 μL，标准阳性质粒 2 μL，加 DEPC 水至 20 μL。 1.11 数据分析
反应程序为 94.0 ℃ 预变性 30 s；94.0 ℃ 变性 5 s，
所有数据使用 Excel 进行数据统计，采用
55.0 ℃ 退火/延伸 20 s，40 个循环，根据各反应
SPSS Statistics 25 软 件 进 行 差 异 显 著 性 分 析
C 值建立标准曲线，确定最低检测限。
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(P＜0.05)，采用 Graphpad Prism 9.5 软件进行绘图，
1.9 RT-qPCR 重复性检测 采用 MEGA11 软件进行系统发育树分析，实验数
以 浓 度 为 10 、 10 、 10 个 /μL 拷 贝 数 的 p- 值用平均值±标准差 (mean±SD) 表示。
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IPNV 1 质粒为模板，采用 20 μL 反应体系进行批
内和批间 RT-qPCR 扩增，其中 2×Premix Ex Taq 2 结果
10 μL， 引 物 均 1 μL， 标 准 阳 性 质 粒 2 μL， 加
2.1 RT-qPCR 最佳引物浓度
DEPC 水至 20 μL。反应程序为 94.0 ℃ 预变性 30 s；
94.0 ℃ 变性 5 s，55.0 ℃ 退火/延伸 20 s，40 个循 为了确定 RT-qPCR 反应体系中引物最佳浓度，
环。批内检测每个稀释度设置 5 个平行样本测试， 分 别 设 置 引 物 浓 度 为 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、
批间重复每个稀释度设置 3 个平行样本，计算批 0.7 μmol/L 的 6 个 浓 度 梯 度 ， 对 IPNV 的 cDNA
内和批间变异系数。 样 本 进 行 RT-qPCR。 当 引 物 浓 度 为 0.5、 0.6、
0.7 μmol/L 时，C 值最低且 3 组间无显著性差异
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1.10 样本检测及基因分型
(图 1)，故选定用量最少的 0.5 μmol/L 作为反应体
取本实验室保存的 30 份细胞培养物样本，编 系的最佳引物浓度。经过优化后 RT-qPCR 反应体
号为 1~30，其中 1~22 为 IPNV 阳性，23~30 为阴 系确定为 2×Premix Ex Taq 10 μL，引物各 1 μL，
性。按照"病毒 RNA 的提取"部分中所述方法进行
模板 cDNA 100 ng，加 DEPC 水至 20 μL。
RNA 的提取，并反转录合成 cDNA。以其 cDNA
为模板，先进行 RT-qPCR 检测，引物序列见表 1， 2.2 RT-qPCR 最佳退火温度
采用 20 μL 反应体系，其中 2×Premix Ex Taq 10 μL， 为了确定 RT-qPCR 的最佳反应条件，分别设
引物各1 μL，模板 cDNA 100 ng，加 DEPC 水至 置退火温度为 55.0、56.2、57.1、58.2、59.3、60.4、
20 μL。反应程序为 94.0 ℃ 预变性 30 s；94.0 ℃ 61.3、62.1、63.0 ℃ 的 9 个温度梯度，对 IPNV 的
变性 5 s，55.0 ℃ 退火/延伸 20 s，40 个循环。每 cDNA 样本进行 RT-qPCR 扩增。当退火温度为
个样本进行 2 次独立重复实验，反应结束后判定 25
检测结果。若待测样本 C 值≤35 且出现典型的 a b c d d d
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扩增曲线，则判定为阳性；若待测样本无 C 值或 20
t
无扩增曲线，则判定为阴性；若 35＜C 值≤40 应
t
进行重复检测，若仍有 C 值和典型的扩增曲线则 15
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为阳性，否则为阴性。 C t 值 C t value
将 IPNV 阳性样本进行 PCR 分型检测，以阳 10
性样本 cDNA 为模板，使用 IPNV-1-F、IPNV-1-R 5
和 IPNV-5-F、IPNV-5-R 两对引物分别进行 PCR
反应。采用 25 μL 反应体系，其中 rTaq 13 μL[Pre- 0
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
mix Taq ]，引物各 1 μL，22 份样本 cDNA 模板
TM
引物浓度/(μmol/L)
100 ng，加 DEPC 水至 25 μL，反应程序为 94.0 ℃ primer concentration
预变性 4 min；94.0 ℃ 变性 30 s，55.0 ℃ 退火 30 s， 图 1 不同引物浓度条件下的 C t 值
72.0 ℃ 延伸 60 s，40 个循环；72.0 ℃ 延伸 10 min。 不同字母表示各组间差异显著 (P＜0.05)；下同。
PCR 反应结束后使用 1% 琼脂糖凝胶电泳，拍 Fig. 1 C t values at different primer concentrations
照分析鉴定。若待测样本使用 IPNV 1 特异性检测
Different letters indicate significant difference among groups (P<0.05);
引物扩增出 502 bp 条带，则判定为 1 型；若待测 the same below.

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