Page 225 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 水 产 学 报 50 卷

业的发展。其中，病毒性疾病由于其感染性强、 用 PCR 扩增获得基因片段后经测序，再利用系统
传播快、致死率高等特点，成为制约我国鲑鳟 进化分析法进行 IPNV 基因分型，耗时费力。因
产业的主要病害。传染性胰脏坏死病 (infectious 此，为了建立灵敏度高、特异性强、快速便捷的
pancreatic necrosis，IPN) 是目前严重威胁我国乃至 病原检测及基因分型方法，本研究基于 VP2 基因
全球鲑鳟养殖业的主要病毒病之一，为我国三类动 序列保守片段设计了用于 IPNV 高效定量检测的
物疫病。该病主要危害鲑鳟类幼鱼 ，由于毒株 RT-qPCR 引物；进一步针对 IPNV 1 型和 5 型毒
[6]
差异，导致患鱼死亡率可从 10%~90% 不等 。 株特异性片段，设计了 PCR 引物。本研究可为我
[7]
IPN 的病原传染性胰脏坏死病毒 (IPNV) 属 国 IPNV 的全面监测提供高效技术手段。
双 RNA 病毒科 (Birnaviridae)。该科病毒是由 A、
1 材料与方法
B 两段组成的双链 RNA (dsRNA) 病毒，分为 4 个
属，即禽双 RNA 病毒属 (Avibirnavirus)、水生双
1.1 实验材料
RNA 病毒属 (Aquabirnavirvirus)、昆虫双 RNA 病
毒 属 (Entomobirnavirvirus) 和 Blosnarvirus。 利 用 IPNV 毒 株 [16] 和 传 染 性 造 血 器 官 坏 死 病 毒
交叉中和测定法可将水生双 RNA 病毒分为 A 和 (IHNV) [21] 均由本实验室分离、鉴定并保存，病毒
[8]
B 两个血清群 ，血清群 A 包含 9 种血清型，即 性出血性败血症病毒 (VHSV) 购自中国典型培养
A1~A9，血清群 B 仅有血清型 B1。利用系统发育 物 保 藏 中 心 (CCTCC)。 TRIzol® Reagent
分析方法，可将水生双 RNA 病毒分为 7 个基因组， (15596018C, Invitrogen，美国)、pMD™ 18-T Vec-
包括基因组 1~7 型 [9-10] 。水生双 RNA 病毒属分为 tor Cloning Kit (6011)、 DL1 000 DNA Marker
IPNV 和 海 洋 双 RNA 病 毒 (marine birnaviruses， (3591Q)、 PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis
MABV) ，其中 IPNV 存在基因组 1~6 型，MABV Kit (D6201A)、 Premix Taq (RR910Q) 和 Premix
TM
[11]
为 7 型。自 1957 年在美国的美洲红点鲑 (Salv- Ex Taq (Probe qPCR)(RR390A) 购自 TaKaRa (日
TM
[12]
elinus fontinalis) 中首次被分离至今 ，IPNV 在世 本)，DEPC 水 (BL510B) 购自 Biosharp 公司。
界范围内广泛传播，严重威胁全球鲑鳟类养殖业。
1.2 引物设计与合成
[13]
IPNV 于 20 世纪 80 年代传入我国 ，目前广泛分
根据 GenBank 及本实验室分离保存的 IPNV
布在东北、西北、西南等虹鳟养殖区域 [14-15] 。流
1 型 分 离 株 (IPNV 1) 和 5 型 分 离 株 (IPNV 5) 的
行病学调查研究显示，目前威胁我国虹鳟养殖场
的 IPNV 主要为 1 型和 5 型，分别属于不同血清 VP2 基因序列设计引物 (表 1)，引物浓度均调整
为 10.0 μmol/L。所有引物委托黑龙江箭速基因科
型。原始祖先重塑研究进一步揭示，我国 1 型
技有限公司合成。
IPNV 很可能是于 20 世纪 80 年代由日本 IPNV 分
化而来，并且在 2006 年进一步分化出两大分支； 1.3 病毒 RNA 的提取
而我国 5 型 IPNV 分离株与意大利的 IPNV 分离株
取 250 μL IPNV 细胞培养物加入 750 μL TRI-
具 有 最 近 的 共 同 原 始 祖 先 [16] 。 不 同 基 因 型 的
zol 试剂进行裂解，混匀后静置 10 min。按 TRI-
IPNV 毒株基因序列差异较大，甚至编码的蛋白大
zol∶氯仿体积比 5∶1 加入氯仿，涡旋振荡混匀
小也不相同，如 IPNV 1 型毒株 VP2 基因序列通
30 s，置于冷冻离心机 12 000 r/min 离心 15 min，
常为 1 326 bp，而 IPNV 5 型毒株 VP2 基因序列可
取上层液体加入 500 µL 异丙醇，混匀后冰上静置
为 1 536 或 1 539 bp。该情况导致这 2 种基因型毒
10 min，置于冷冻离心机 12 000 r/min 离心 10 min，
株保守性较差，且毒力差异较大，给 IPNV 的检
弃上清液。加入 1 mL 的 75% 冰乙醇混匀，置于
测和防控带来巨大挑战。
冷冻离心机 8 000 r/min 离心 5 min。弃上清液，待
目前 IPNV 的检测方法主要包括免疫学方法
残留乙醇挥发后加入 30 µL 的 DEPC 水溶解。病
[17]
如中和实验 、酶联免疫吸附实验 ( ELISA) 法 ，
[18]
毒 RNA 分装后置于−80.0 ℃ 储存。
以及分子生物学方法如聚合酶链式反应 (PCR) [19]
1.4 用于绘制标准曲线的阳性质粒的制备
和实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) [20] 等。但现有方
法均无法直接对 IPNV 进行基因分型，只能先利 为了对我国现有基因型毒株的扩增效率进行
https://www.china-fishery.cn 中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries
2