Page 226 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 刘威彤，等：传染性胰脏坏死病毒 (IPNV) 检测及区分 1、5 基因型方法的建立及应用 50 卷

表 1 本研究所用的引物
Tab. 1 Primers used in this study
引物 序列 备注
primer sequences (5′-3′) notes
IPNV-qPCR-F AAGTAYGACCCYGARGGYCT IPNV检测引物
IPNV-qPCR-R ATGTCCAGCTCCTCYCTGTG
IPNV-Probe 5'FAM-AACTATGCCAAGATGATCCTGTC-3'MGB
IPNV-1-F CGCTGGTCTGTATGCACTCAATG IPNV 1 特异性分型引物
IPNV-1-R CGTGGAGCTTGTCACGGTGA
IPNV-5-F CGACATTCAAAGCTCCACACTACCG IPNV 5特异性分型引物
IPNV-5-R TTGTCGTTTGTGGCCAGCACG
VP2 G1 F TCCGTCGATGGCGAAAGC 扩增IPNV 1 VP2序列引物
VP2 G1 R GCTGAGTTGGTCTTGGTG
VP2 G5 F TCAACGTTAGTGGTAACCCACG 扩增IPNV 5 VP2序列引物
VP2 G5 R TGGAAGCTCGACTTCCTCGTAG
IHNV-qPCR-F CGATTCACACCCAAGGGAACT IHNV检测引物
IHNV-qPCR-R CGAAGAACCCTGTTGAGCAGAT
IHNV-Probe 5'FAM-ATCCACAAAGTCCTGTACCG-3'MGB
VHSV-qPCR-F AAACTCGCAGGATGTGTGCGTCC VHSV检测引物
VHSV-qPCR-R TCTGCGATCTCAGTCAGGATGAA
VHSV-Probe 5'FAM-TAGAGGGCCTTGGTGATCTTCTG-3'BHQ1

检验，构建了带有 IPNV 1 和 IPNV 5 VP2 全长基因 1.6 RT-qPCR 最佳退火温度的确定
序列的 2 个阳性质粒。将本实验室保存的 IPNV 1 以 IPNV 病毒 RNA 反转录得到的 cDNA 为模
毒株 HLJ2019-1 和 IPNV 5 毒株 BJ2020-1 的 RNA 板，采用 20 μL 反应体系进行 RT-qPCR 扩增，经
用 PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒 过优化后反应体系确定为 2×Premix Ex Taq 10 μL，
反转录合成 cDNA 作为模板，利用引物进行 PCR 引物各 1 μL，模板 cDNA 100 ng，加 DEPC 水至
扩 增 。 将 扩 增 产 物 克 隆 至 pMD18-T 载 体 上 20 μL。将标准程序中退火温度改为 55.0、56.2、
(pMD 18-T Vector Cloning Kit)，构建标准质粒， 57.1、58.2、59.3、60.4、61.3、62.1、63.0 ℃，9 个
TM
将其命名为 p-IPNV 1 和 p-IPNV 5。根据质粒浓度 温度梯度。每个样本重复检测 3 次，根据各反应
计算拷贝数，用于 RT-qPCR 灵敏度、重复性检测。 C 值确定 RT-qPCR 反应的最佳退火温度。
t
1.5 RT-qPCR 引物最佳检测浓度的确定 1.7 RT-qPCR 特异性检测

以 IPNV 病毒 RNA 反转录得到的 cDNA 为模 分别用 IPNV 1、IPNV 5、IHNV、VHSV 病
板，采用 20 μL 反应体系进行 RT-qPCR 扩增，其 毒 RNA 反转录得到的 cDNA 为模板，采用 20 μL
中 2×Premix Ex Taq[Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)] 反应体系进行 RT-qPCR 扩增，其中 2×Premix Ex
Taq 10 μL，引物各 1 μL，模板 cDNA 100 ng，加
10 μL，3 条引物的浓度设置为 0.2、0.3、0.4、0.5、
DEPC 水至 20 μL。经过优化后反应程序确定为
0.6、0.7 μmol/L 等 6 个浓度梯度，模板 cDNA 为
94.0 ℃ 预变性 30 s；94.0 ℃ 变性 5 s，55.0 ℃ 退
100 ng，加 DEPC 水至 20 μL。反应程序参考试剂
火/延伸 20 s，40 个循环，根据各反应 C 值验证
t
盒推荐标准程序进行：94.0 ℃ 预变性 30 s；94.0 ℃
RT-qPCR 检测的特异性。
变性 5 s，60.0 ℃ 退火/延伸 20 s，40 个循环。每
个样本重复检测 3 次，根据出现阳性信号的最小 1.8 RT-qPCR 灵敏度检测
循环数，即循环阈值 Ct 确定 RT-qPCR 反应体系 将标准阳性质粒 p-IPNV 1 和 p-IPNV 5 分别
中的最佳引物浓度。 稀释为 10 ~10 个/μL 拷贝数的浓度梯度，以各稀
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